ניתוח של חיבור קצה לא הומולוגי ויעילות רקומבינציה הומולוגית בתאי HEK-293T באמצעות מערכות דיווח מבוססות GFP

שברים דו-גדיליים בדנ"א מייצגים את נגעי הדנ"א המסוכנים ביותר. בתגובה, תאים משתמשים בשני מנגנונים עיקריים לתיקון שבר דו-גדילי DNA, NHEJ ו-HR. כימות היעילות של NHEJ ומשאבי אנוש בנפרד הוא חיוני לחקר המנגנונים והגורמים הרלוונטיים הקשורים אליהם. בדיקת NHEJ ובדיקת משאבי אנוש הן שיטות מבוססות המשמשות למדידת היעילות של NHEJ ו- HR. שיטות אלה מסתמכות על פלסמידים שתוכננו בקפידה ומכילים גן חלבון פלואורסצנטי ירוק משובש עם אתרי זיהוי עבור אנדונוקלאז I-SceI להשראת DSBs.

ניתן לבצע את בדיקת NHEJ ואת בדיקת משאבי אנוש באמצעות גישה משולבת כרומוזומלית או חוץ-כרומוזומלית. הגישה המשולבת כרומוזומלית מאפשרת ניתוח של תיקון DSB בתוך תחרות כרומוזומלית. עם זאת, הגישה המשולבת כרומוזומלית דורשת תאים ממושכים ואינה מתאימה למחקרים השוואתיים המערבים קווי תאים מרובים.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את מבחני NHEJ ו- HR החוץ-כרומוזומליים הכוללים טרנספקציה חולפת של פלסמידים GFP ו- I-SceI משובשים לתאי HEK-293T וניתוח ציטומטריית זרימה לאחר מכן. מבחני כתבים לא משולבים אלה שימשו להערכת יעילות NHEJ ויעילות משאבי אנוש על ידי מספר מעבדות, כולל שלנו. בניגוד לגישה המשולבת כרומוזומלית, גישה חוץ-כרומוזומלית זו מאפשרת ניתוח מהיר של יעילות NHEJ או HR באמצעות ניצול קווי תאים מבוססים ויציבים.