يصف هذا البروتوكول فحصا خلويا لمراقبة كفاءة الربط، باستخدام مراسل إدارة قابل للتكيف. يمكن استخدام هذا الفحص المراسل لدراسة آثار الطفرات المرتبطة بالمرض في مواقع إكسون أو الوصلة ، ولتصميم العلاج ، وخاصة جسيمات واحدة ، لتحسين التعرف على مواقع الربط المتحورة إلى خمس نقاط. يؤدي المرور في خلايا هيلا إلى شفط الوسط المستنفد واحتضان الخلايا بثلاثة ملليلتر من 0.2 5٪ من الرحلات في احتواء ملليمولار واحد EDTA ، عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.
بعد الحضانة في سبعة ملليلتر من DMEM الطازج ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 10 ملليلتر. الطرد المركزي للخلايا. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من DMEM الطازج ، وقم بطلاء الخلايا على طبق جديد لزراعة الأنسجة عند التقاء 20٪ ، للانتقال العابر.
عد خلايا hela مع شريحة مقياس خلايا هيمو نظيفة وإعداد تعليق بكثافة 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر ، وزرع ملليلتر واحد من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة بئر 12 وحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بشفط الوسط المستنفد وأضف 800 ميكرولتر من DMEM الطازج مع المصل إلى الطبق. تحضير خلطات النقل ودوامها لمدة 15 ثانية.
ثم الطرد المركزي للخلطات واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، أضف كل 200 ميكرولتر من مزيج النقل إلى بئر واحد من صفيحة خلية هيلا البئر ال 12 لتحقيق حجم نهائي قدره ملليلتر واحد لكل بئر ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ردود الفعل المعدة لوضع العلامات هي الاحتضان.
أعد تعليق حبات استبعاد حجم قطع الوزن الجزيئي من دالتون التي يبلغ وزنها 25 كيلوغراما عن طريق دوامة لطيفة لمدة 10 ثوان. بعد ذلك ، قم بنقل 600 ميكرولتر من الخرز المعاد تعليقه إلى عمود صغير يمكن التخلص منه ، يتم وضعه في أنبوب تجميع 1.5 ملليلتر ، ويعيد مخزون الخرز إلى أربع درجات مئوية. الطرد المركزي للعمود وتجاهل التدفق من خلالها.
ثم اغسل الخرز مرتين بإضافة 300 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي إلى العمود. بعد الغسيل الثاني ، انقل العمود الصغير إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف مزيج تفاعل كيناز إلى العمود. الطرد المركزي للعمود وجمع التدفق من خلال احتواء P32 المسمى oligonucleotides.
أضف ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المستخرج من خلايا الهليكوبتر إلى أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 200 ميكرولتر وأضف ماء خاليا من الحمض النووي الريبي لتكوين الحجم إلى 6.55 ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف 0.9 ميكرولتر ، امزج واحدا إلى كل أنبوب PCR يحتوي على عينات الحمض النووي الريبي ، واحتضن الأنابيب أولا عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم على الجليد لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك في 2.55 ميكرولتر ، مزيج رئيسي اثنين ، لكل أنبوب يحتوي على الحمض النووي الريبي وخلط رئيسي واحد ، واحتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
بعد الحضانة ، تنقل الأنابيب إلى جهاز تدوير حراري وتحضن أولا عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، ثم عند 70 درجة مئوية ، لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف 10 ميكرولترات من صبغة تحميل الحمض النووي الريبي 2X formamide إلى كل عينة ، وانتقل إلى فصل الأجزاء بواسطة صفحة UIA. بيرسي تخليق الحمض النووي.
أضف ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المستخرج من خلايا الهلا المنقولة ، إلى أنابيب 200 ميكرولتر ميكرون طرد مركزي وأضف ماء خاليا من الحمض النووي الريبي لتكوين الحجم إلى 11 ميكرولتر منخفض. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين ، وامزج واحدا لكل عينة واحتضنه أولا عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم على الجليد لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، أضف سبعة ميكرولترات ، وامزج اثنين من كل أنبوب واحتضن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، تليها الحضانة عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة و 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
بعد ذلك ، بالنسبة ل PCR ، قم بتخفيف تفاعل الحمض النووي C لإنتاج تركيز 100 نانوغرام لكل ميكرولتر ، ونقل ميكرولتر واحد من كل عينة CDNA إلى أنابيب PCR جديدة. أضف 10.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل أنبوب يحتوي على CDNA ، وقم بإجراء PCR. استخدام جهاز تدوير حراري بعد اكتمال PCR.
أضف 12.5 ميكرولتر من صبغة تحميل الحمض النووي فورماميد 2X إلى كل أنبوب. قم بتسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، وتابع إجراء صفحة UIA. ماصة خمسة ميكرولترات من CDNA المخفف في آبار فردية من لوحة qpcr 96 بئرا ثلاثية الأبعاد.
بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من مزيج PCR في الوقت الفعلي إلى كل بئر ، وأغلق الألواح بفيلم بصري ، وأجهزة طرد مركزي لجمع التفاعلات إلى قاع الآبار ، ثم قم بإجراء qpcr أثناء جمع قيم دورة القياس الكمي للعتبة للأمبليكون المستهدف. قبل تحميل العلامات والعينات ، اطرد الآبار باستخدام مخزن مؤقت TBE لإزالة اليوريا المستقرة. ثم قم بتحميل 10 ميكرولترات من كل عينة لكل بئر وقم بتشغيل الجل عند 300 إلى 500 فولت لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات ، أو حتى يصل الزيلين إلى القاع.
بعد الرحلان الكهربائي ، قم بإزالة الألواح الزجاجية من جهاز الرحلان الكهربائي وفصل اللوحتين بعناية بحيث يضع الجل مسطحا على أي من السطحين الزجاجيين ، ثم انقل الجل إلى ورقة ترشيح وقم بتغطيته بغلاف بلاستيكي ، باستخدام مجفف هلام بالمكنسة الكهربائية ، قم بتجفيف الجل عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم ضع الجل المجفف في كاسيت تصوير فوسفوري للحضانة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. عند التعبير عنها في خلايا هيلا، يعبر مراسل التقطيع dup 51 minnijean عن النص الكامل الناضج الذي يتم فيه ربط إكسون تو بكفاءة. تقلل طفرات موقع الربط الخمسة الرئيسية و dup 51 P من إدراج إكسون مرتين من 95 إلى 30٪ مما يؤدي إلى تكوين نسخة أقصر.
إن التعبير المشترك عن dup 51 P مع U15A SNRNA ينقذ إكسون من اثنين من الربط ، ويعيد تشكيل النص الكامل الطول. في المقابل ، لا يكون للتعبير المشترك مع متغير U1 أو U15G من النوع البري تأثير مماثل على ربط dup 51P. الكشف عن نسخ المتغيرات U15A ، عن طريق الامتداد الأولي يستخدم U1 سبعة إلى 26 أوليغو نيوكليوتيد ، وهو 20 نيوكليوتيدات طويلة وأزواج قاعدة بالقرب من الأدينين في الموضع الخامس من U1 SNRNA.
في وجود DATP وحده ، يسمح U1 من سبعة إلى 26 بدمج اثنين إلى ثلاثة نيوكليوتيدات للنوع البري الداخلي U1 SNRNA مما ينتج عنه منتج طويل من 22 أو 23 نيوكليوتيد. بالنسبة لمتغيرات U15A و U15G ، ينتهي التمديد بعد إضافة أدينوزين واحد ينتج منتجا من 21 نيوكليوتيد. بعد التطبيع إلى تعبير U2 SNRNA ، تم التعبير عن المتغيرات U1 من النوع البري U1 5g و U15A المنقولة بثلاثة إلى خمسة أضعاف فوق SNRNA الذاتية.
تعد جودة الحمض النووي الريبي المستخرج أمرا بالغ الأهمية لتحليل الربط. لذلك ، يوصى بشدة باستخدام المياه الخالية من الحمض النووي الريبي ، وإزالة التلوث من الخدمات بعوامل تعطيل الحمض النووي الريبي. يمكن تطبيق نظام التقرير الموصوف هنا لدراسة دور الحمض النووي الريبي U1 SN في لوائح الربط لعكس تأثير طفرات ربط سعر الفلاش لإسكات الجينات باستخدام تعديل الحمض النووي الريبي U1SN.
