GFPベースのレポーターシステムを用いたHEK-293T細胞の非相同末端結合および相同組換え効率の解析

DNA二本鎖切断は、最も危険なDNA損傷です。これに対して、細胞はDNA二本鎖切断修復のための2つの主要なメカニズム、NHEJとHRを採用しています。NHEJとHRの効率性を別々に定量化することは、それらに関連するメカニズムと要因を調査するために重要です。NHEJアッセイとHRアッセイは、NHEJとHRの効率を測定するために使用される確立された方法です。これらの方法は、DSBの誘導のためのエンドヌクレアーゼI-SceIの認識部位を持つ破壊された緑色蛍光タンパク質遺伝子を含む、細心の注意を払って設計されたプラスミドに依存しています。

NHEJアッセイおよびHRアッセイは、染色体統合アプローチまたは染色体外アプローチを使用して実施できます。染色体統合アプローチにより、染色体コンテスト内でのDSB修復の解析が可能になります。しかし、染色体統合アプローチは長期の細胞を必要とし、複数の細胞株を含む比較研究には適していません。

このプロトコールでは、破壊されたGFPおよびI-SceIプラスミドのHEK-293T細胞への一過性トランスフェクションとその後のフローサイトメトリー分析を含む染色体外NHEJおよびHRアッセイについて説明します。これらの非統合レポーターアッセイは、当社のラボを含むいくつかのラボでNHEJ効率とHR効率の評価に採用されています。染色体統合アプローチとは対照的に、この染色体外アプローチでは、確立された安定した細胞株を利用することで、NHEJまたはHRの効率を迅速に分析できます。