HEK-293T Hücrelerinde Homolog Olmayan Uç Birleştirme ve Homolog Rekombinasyon Etkinliğinin GFP Tabanlı Raporlayıcı Sistemler Kullanılarak Analizi

DNA çift sarmallı kırılmaları en tehlikeli DNA lezyonlarını temsil eder. Buna karşılık, hücreler DNA çift sarmallı kopma onarımı için iki ana mekanizma kullanır: NHEJ ve HR. NHEJ ve İK'nın verimliliğini ayrı ayrı ölçmek, bunlarla ilişkili ilgili mekanizmaları ve faktörleri keşfetmek için çok önemlidir. NHEJ testi ve HR testi, NHEJ ve HR'nin verimliliğini ölçmek için kullanılan yerleşik yöntemlerdir. Bu yöntemler, DSB'lerin indüksiyonu için endonükleaz I-SceI için tanıma bölgelerine sahip bozulmuş bir yeşil floresan protein geni içeren titizlikle tasarlanmış plazmitlere dayanır.

NHEJ testi ve HR testi, kromozomal olarak entegre veya ekstrakromozomal bir yaklaşım kullanılarak gerçekleştirilebilir. Kromozomal olarak entegre yaklaşım, kromozomal olarak bir yarışma içinde DSB onarımının analizini sağlar. Bununla birlikte, kromozomal olarak entegre yaklaşım, uzun süreli hücre gerektirir ve çoklu hücre hatlarını içeren karşılaştırmalı çalışmalar için uygun değildir.

Bu protokolde, bozulmuş GFP ve I-SceI plazmitlerinin HEK-293T hücrelerine geçici transfeksiyonunu ve ardından akış sitometrisi analizini içeren ekstrakromozomal NHEJ ve HR testlerini tarif ediyoruz. Bu entegre olmayan raportör tahlilleri, bizimki de dahil olmak üzere çeşitli laboratuvarlar tarafından NHEJ verimliliğini ve İK verimliliğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Kromozomal olarak entegre yaklaşımın aksine, bu ekstrakromozomal yaklaşım, yerleşik, kararlı hücre hatlarının kullanılması yoluyla NHEJ veya HR verimliliğinin hızlı bir şekilde analiz edilmesini sağlar.