Анализ эффективности негомологичного соединения концов и гомологичной рекомбинации в клетках HEK-293T с использованием репортерных систем на основе GFP

Двухцепочечные разрывы ДНК представляют собой наиболее опасные повреждения ДНК. В ответ на это клетки используют два основных механизма репарации двухцепочечного разрыва ДНК: NHEJ и HR. Количественная оценка эффективности NHEJ и HR по отдельности имеет решающее значение для изучения соответствующих механизмов и факторов, связанных с ними. Анализ NHEJ и анализ HR являются установленными методами, используемыми для измерения эффективности NHEJ и HR. Эти методы основаны на тщательно спроектированных плазмидах, которые содержат разрушенный ген зеленого флуоресцентного белка с сайтами узнавания эндонуклеазы I-SceI для индукции DSB.

Анализ NHEJ и анализ HR могут быть проведены с использованием хромосомно-интегрированного или внехромосомного подхода. Хромосомно-интегрированный подход позволяет анализировать репарацию DSB в рамках хромосомной борьбы. Однако хромосомно-интегрированный подход требует пролонгированной клетки и не подходит для сравнительных исследований с участием нескольких клеточных линий.

В этом протоколе мы описываем внехромосомные анализы NHEJ и HR, включающие транзиторную трансфекцию разрушенных плазмид GFP и I-SceI в клетки HEK-293T и последующий анализ проточной цитометрии. Эти неинтегрированные репортерные анализы были использованы для оценки эффективности NHEJ и эффективности управления персоналом в нескольких лабораториях, включая нашу. В отличие от хромосомно-интегрированного подхода, этот внехромосомный подход позволяет быстро анализировать эффективность NHEJ или HR за счет использования сложившихся, стабильных клеточных линий.