زراعة غشاء حيوي متعدد الميكروبات ذي صلة بالتليف الكيسي لاستكشاف الأنماط الظاهرية للمجتمع

نحن نحاول فهم كيفية تصرف الميكروبات عندما تنمو في ظروف تحاكي ظروف الحياة الواقعية ، بهدف تحديد الآليات التي تقود التغيرات المظهرية في المجتمعات متعددة الأنواع مقارنة بنمو الزراعة الأحادية. من خلال استخدام هذا النظام في المختبر ، قمنا بتمييز مسار جزيئي يقود المتمردين من Pseudomonas aeruginosa ، وهو عامل ممرض سيئ السمعة في سياق التهابات مجرى الهواء بالتليف الكيسي. نظرا لشكلها المكون من 96 بئرا ومع ظروف النمو التي تعكس تلك التي لوحظت في رئة التليف الكيسي ، يمكننا استكشاف مجموعة واسعة من تفاعلات الميكروبيوم بسهولة.

لقد اكتسبنا نظرة ثاقبة حول الآليات الكامنة وراء قابلية الميكروبات لمضادات الميكروبات في سياق الميكروبيوم بالكامل. يعمل نموذجنا كجسر بين الملاحظات السريرية والعمل المختبري الفردي في أبحاث التليف الكيسي ، مما يوفر أداة قيمة لدراسة تفاعلات الميكروبيوم المختلفة. للبدء ، قم بإعداد جميع الكواشف والوسائط المطلوبة.

بالنسبة لتجربة الزراعة المشتركة ، قم بالطرد المركزي للمزارع البكتيرية بين عشية وضحاها ، واغسل الخلايا باستخدام PBS المعقم. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية بعناية وأعد تعليق كل حبيبات في مليلتر واحد من وسط البلغم الاصطناعي المخفف بالماء 1X أو قاعدة ASM. قم بقياس الكثافة البصرية من 1 إلى 10 عينات مخففة عند 600 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي أو في قارئ لوحة.

قم بتخفيف كل عينة بكتيرية إلى كثافة بصرية نهائية عند 600 نانومتر من 0.01 ودوامة جيدا لمدة خمس ثوان. أضف 100 ميكرولتر من معلقات الزراعة الأحادية والزراعة المشتركة إلى ثلاثة آبار منفصلة من صفيحة بلاستيكية معقمة ذات قاع مسطح 96 بئرا واحتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأكسجين. ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإزالة الخلايا العوالق غير المتصلة وتجديد الأغشية الحيوية مسبقة التكوين ب 100 ميكرولتر من ASM الطازج أو كاشف المعالجة المطلوب.

بعد شفط الخلايا العوالق ، اغسل الأغشية الحيوية برفق مرتين باستخدام 125 ميكرولتر من PBS المعقم وتخلص من محلول الغسيل. أضف 50 ميكرولتر من PBS المعقم. وباستخدام مكرر مكون من 96 سنا ، كشط الخلايا برفق من اللوحة.

انقل خلايا الأغشية الحيوية المعلقة إلى الصف A من صفيحة معقمة جديدة مكونة من 96 بئرا وقم بإجراء تخفيف تسلسلي 10X. ضع ثلاثة إلى خمسة ميكرولترات من كل عينة تخفيف على ألواح الأجار. بعد أن تجف بقع التلقيح ، احتضن الألواح بشكل مناسب.

لوحظت العديد من الأنماط الظاهرية ، بما في ذلك انخفاض عدد خلايا Pseudomonas aeruginosa و Staphylococcus aureus القابلة للحياة عند زراعتها في مجتمع عوالق مختلط مقارنة بالزراعة الأحادية. لوحظت زيادة في النمو متعدد الميكروبات للعقدية السانجوينيس ونمو المجتمع المختلط ل Prevotella melaninogenica.