Мы пытаемся понять, как ведут себя микробы при выращивании в условиях, имитирующих реальные условия жизни, с целью определить механизмы, вызывающие фенотипические изменения в многовидовых сообществах по сравнению с монокультурным ростом. Используя эту систему in vitro, мы охарактеризовали молекулярный путь, управляющий непокорными Pseudomonas aeruginosa, печально известным патогеном в контексте инфекций дыхательных путей при муковисцидозе. Благодаря формату 96-луночных планшетов и условиям роста, отражающим те, которые наблюдаются в легких с муковисцидозом, мы можем легко исследовать широкий спектр взаимодействий микробиома.
Мы получили представление о механизмах, лежащих в основе чувствительности микробов к противомикробным препаратам в контексте микробиома. Наша модель служит связующим звеном между клиническими наблюдениями и индивидуальной лабораторной работой в исследованиях муковисцидоза, предлагая ценный инструмент для изучения различных взаимодействий микробиома. Для начала подготовьте все необходимые реактивы и среды.
Для эксперимента по совместному культивированию бактериальные культуры центрифугируют в течение ночи и промывают клетки стерильным PBS. После центрифугирования осторожно выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую гранулу в одном миллилитре искусственной мокроты, разведенной в 1Х водой, или на основе ASM. Измерьте оптическую плотность от 1 до 10 разбавленных образцов на расстоянии 600 нанометров с помощью спектрофотометра или планшетного ридера.
Разбавьте каждый бактериальный образец до окончательной оптической плотности при 600 нанометрах 0,01 и тщательно перемешайте в течение пяти секунд. Добавьте 100 микролитров суспензий монокультуры и сокультуры в три отдельные лунки стерильного пластикового 96-луночного планшета с плоским дном и инкубируйте планшет в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия в бескислородных условиях. Затем с помощью многоканальной пипетки удалите неприкрепленные планктонные клетки и пополните предварительно сформированные биопленки 100 микролитрами свежего ASM или желаемым реагентом для лечения.
После аспирации планктонных клеток аккуратно промойте биопленки два раза 125 микролитрами стерильного PBS и выбросьте раствор для промывки. Добавьте 50 микролитров стерильного PBS. И с помощью 96-контактного репликатора аккуратно соскоблил клетки с пластины.
Перенесите ресуспендированные биопленочные клетки в ряд А нового стерильного 96-луночного планшета и выполните 10-кратное серийное разведение. Выложите от трех до пяти микролитров каждого образца разбавления на агаровые планшеты. После того как пятна от инокуляции высохнут, инкубируйте планшеты соответствующим образом.
Наблюдалось несколько фенотипов, в том числе снижение количества жизнеспособных клеток Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus при выращивании в смешанном планктонном сообществе по сравнению с монокультурой. Наблюдалось увеличение полимикробного роста Streptococcus sanguinis и роста смешанного сообщества Prevotella melaninogenica.
