私たちは、実生活を模倣した条件で成長した微生物がどのように振る舞うかを理解しようとしており、単一栽培の成長と比較して、多種コミュニティの表現型の変化を促進するメカニズムを特定することを目標としています。このin vitroシステムの利用により、嚢胞性線維症気道感染症の悪名高い病原体である緑膿菌の難治性を駆動する分子経路を特徴付けました。96ウェルプレートフォーマットと、嚢胞性肺線維症で観察されるものを反映した成長条件により、幅広いマイクロバイオームの相互作用を簡単に探索できます。
私たちは、完全なマイクロバイオームの文脈で微生物が抗菌剤に対する感受性を変える背後にあるメカニズムについての洞察を得ました。私たちのモデルは、嚢胞性線維症研究における臨床観察と個々の研究室研究との間の架け橋として機能し、さまざまなマイクロバイオーム相互作用を研究するための貴重なツールを提供します。まず、必要なすべての試薬と培地を準備します。
共培養実験では、細菌を一晩遠心分離し、無菌PBSで細胞を洗浄します。遠心分離後、上清を慎重に廃棄し、各ペレットを1ミリリットルの1X水希釈人工痰培地またはASMベースに再懸濁します。1〜10個の希釈サンプルの光学密度を600ナノメートルで分光光度計またはプレートリーダーで測定します。
各細菌サンプルを600ナノメートルの0.01の最終光学濃度に希釈し、5秒間完全にボルテックスします。100マイクロリットルの単一培養および共培養懸濁液を滅菌プラスチック平底96ウェルプレートの3つの別々のウェルに加え、無酸素状態でプレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、付着していないプランクトン細胞を取り出し、予め形成されたバイオフィルムに100マイクロリットルの新鮮なASMまたは目的の治療試薬を補充します。
浮遊細胞を吸引した後、バイオフィルムを125マイクロリットルの滅菌PBSで2回穏やかに洗浄し、洗浄液を廃棄します。滅菌PBSの50マイクロリットルを追加します。そして、96ピンリプリケーターを使用して、プレートから細胞をそっとこすり落としました。
再懸濁したバイオフィルム細胞を新しい滅菌96ウェルプレートの列Aに移し、10倍段階希釈を行います。各希釈サンプルの3〜5マイクロリットルを寒天プレートにプレートします。接種スポットが乾いたら、プレートを適切にインキュベートします。
混合プランクトン群集で増殖した場合、単一培養と比較して生存可能な緑膿菌および黄色ブドウ球菌の細胞数の減少を含む、いくつかの表現型が観察されました。Streptococcus sanguinis の多微生物増殖の増加と Prevotella melaninogenica の混合コミュニティ成長が観察されました。
