Cultivo de um biofilme polimicrobiano relevante para fibrose cística para sondar fenótipos da comunidade

Estamos tentando entender como os micróbios se comportam quando cultivados em condições que imitam as condições da vida real, com o objetivo de determinar os mecanismos que impulsionam as mudanças fenotípicas em comunidades multiespécies em comparação com o crescimento da monocultura. Através da utilização deste sistema in vitro, caracterizamos uma via molecular que conduz os recalcitrantes de Pseudomonas aeruginosa, um patógeno notório no contexto de infecções de vias aéreas de fibrose cística. Devido ao seu formato de placa de 96 poços e com condições de crescimento que refletem as observadas no pulmão de fibrose cística, podemos explorar uma ampla gama de interações do microbioma com facilidade.

Obtivemos insights sobre os mecanismos por trás da suscetibilidade dos micróbios aos antimicrobianos em um contexto totalmente microbioma. Nosso modelo serve como uma ponte entre as observações clínicas e o trabalho de laboratório individual na pesquisa da fibrose cística, oferecendo uma ferramenta valiosa para estudar várias interações do microbioma. Para começar, prepare todos os reagentes e meios necessários.

Para o experimento de co-cultura, centrifugue as culturas bacterianas durante a noite e lave as células com PBS estéril. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante com cuidado e ressuspenda cada pellet em um mililitro de meio de escarro artificial diluído em água 1X ou base ASM. Meça a densidade óptica de 1 a 10 amostras diluídas a 600 nanômetros em um espectrofotômetro ou em um leitor de placas.

Diluir cada amostra bacteriana até uma densidade óptica final a 600 nanômetros de 0,01 e vórtice completamente por cinco segundos. Adicione 100 microlitros das suspensões de monocultura e co-cultura a três poços separados de uma placa de plástico estéril de fundo plano de 96 poços e incube a placa por 24 horas a 37 graus Celsius em condições anóxicas. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, remova as células planctônicas soltas e reabasteça os biofilmes pré-formados com 100 microlitros de ASM fresco ou o reagente de tratamento desejado.

Após aspirar as células planctônicas, lave suavemente os biofilmes duas vezes com 125 microlitros de PBS estéril e descarte a solução de lavagem. Adicione 50 microlitros de PBS estéril. E usando um replicador de 96 pinos, raspou suavemente as células da placa.

Transfira as células de biofilme ressuspensas para a linha A de uma nova placa estéril de 96 poços e execute uma diluição serial de 10X. Colocar três a cinco microlitros de cada amostra de diluição nas placas de ágar. Depois que as manchas de inoculação secarem, incube as placas adequadamente.

Vários fenótipos foram observados, incluindo uma redução no número de contagens de células viáveis de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus quando cultivadas em uma comunidade planctônica mista em comparação com a monocultura. Foi observado um aumento no crescimento polimicrobiano de Streptococcus sanguinis e crescimento comunitário misto de Prevotella melaninogenica.