גידול ביופילם פולימיקרוביאלי רלוונטי לסיסטיק פיברוזיס כדי לחקור פנוטיפים קהילתיים

אנו מנסים להבין כיצד מיקרובים מתנהגים כאשר הם גדלים בתנאים המחקים תנאי חיים אמיתיים, במטרה לקבוע את המנגנונים המניעים שינויים פנוטיפיים בקהילות מרובות מינים בהשוואה לגידול מונוקולטורה. באמצעות השימוש במערכת חוץ גופית זו, אפיינו מסלול מולקולרי המניע את הסרבנים של Pseudomonas aeruginosa, פתוגן ידוע לשמצה בהקשר של זיהומי דרכי הנשימה של סיסטיק פיברוזיס. הודות לפורמט של 96 בארות ועם תנאי גדילה המשקפים את אלה שנצפו בריאה של סיסטיק פיברוזיס, אנו יכולים לחקור מגוון רחב של אינטראקציות מיקרוביום בקלות.

השגנו תובנות לגבי המנגנונים שמאחורי הרגישות של חיידקים לתרופות אנטי-מיקרוביאליות בהקשר מיקרוביום מלא. המודל שלנו משמש כגשר בין תצפיות קליניות לבין עבודת מעבדה פרטנית במחקר סיסטיק פיברוזיס, ומציע כלי רב ערך לחקר אינטראקציות מיקרוביום שונות. כדי להתחיל, להכין את כל ריאגנטים נדרשים מדיה.

לצורך ניסוי התרבית המשותפת, צנטריפוגו את תרביות החיידקים למשך הלילה, ושטפו את התאים עם PBS סטרילי. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנאטנט בזהירות ולהשהות מחדש כל גלולה במיליליטר אחד של 1X מדיום כיח מלאכותי מדולל במים או בסיס ASM. מדוד את הצפיפות האופטית של 1 עד 10 דגימות מדוללות ב- 600 ננומטר בספקטרופוטומטר או בקורא לוחות.

לדלל כל דגימת חיידקים לצפיפות אופטית סופית של 600 ננומטר של 0.01 ולערבל היטב במשך חמש שניות. הוסף 100 מיקרוליטר של מתלי מונוקולטורה ותרבות משותפת לשלוש בארות נפרדות של צלחת פלסטיק סטרילית שטוחה 96 בארות ודגרה על הצלחת במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנוקסיים. לאחר מכן באמצעות פיפטה רב ערוצית, להסיר את התאים הפלנקטוניים שאינם מחוברים ולחדש את הביופילמים מוכנים עם 100 מיקרוליטר של ASM טרי או מגיב הטיפול הרצוי.

לאחר שאיפת התאים הפלנקטוניים, שטפו בעדינות את הביופילמים פעמיים עם 125 מיקרוליטר של PBS סטרילי והשליכו את תמיסת השטיפה. הוסף 50 מיקרוליטר של PBS סטרילי. ובאמצעות משכפל של 96 פינים, גירדו בעדינות את התאים מהצלחת.

מעבירים את תאי הביופילם המרחפים לשורה A של צלחת סטרילית חדשה בעלת 96 בארות ומבצעים דילול טורי פי 10. צלחת שלושה עד חמישה מיקרוליטר מכל דגימת דילול על לוחות אגר. לאחר שכתמי החיסון מתייבשים, דוגרים על הצלחות כראוי.

נצפו מספר פנוטיפים, כולל ירידה במספר ספירות התאים Pseudomonas aeruginosa ו- Staphylococcus aureus כאשר גדלו בקהילה פלנקטונית מעורבת בהשוואה למונוקולטורה. נצפתה עלייה בגידול פולימיקרוביאלי של Streptococcus sanguinis וצמיחה קהילתית מעורבת של Prevotella melaninogenica.