في هذا البروتوكول ، نهدف إلى توفير برنامج تعليمي سهل المتابعة خطوة بخطوة حول كيفية جمع وتخزين الدم المحيطي عالي الصلاحية والخلايا أحادية النواة ، أو PBMCs ، من الدم الكامل. تشمل PBMCs الخلايا الليمفاوية والخلايا المتغصنة والوحيدات. يمكن معالجة PBMCs السائبة لعزل أنواع الخلايا الفردية وتستخدم بشكل شائع في مجموعة متنوعة من التجارب والمقايسات ، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي وقياس التدفق الخلوي.
بالإضافة إلى PBMCs ، نوضح أيضا كيفية جمع بلازما EDTA ومعطف بافي الكامل. قبل البدء في هذا البروتوكول ، يرجى إعداد المواد والكواشف المدرجة في الجدول 2. لاحظ أن هذا البروتوكول مصمم لجمع PBMCs من ستة أنابيب طرد مركزي متدرجة الكثافة ، ينتج كل منها ما يقرب من 12 مليون خلية.
مقياس وفقا لذلك. باستخدام تقنية الفصد القياسية ، اجمع الدم الكامل في ستة أنابيب طرد مركزي متدرجة الكثافة وأنبوب EDTA واحد حتى يتم ملؤه. أجهزة الطرد المركزي جميع الأنابيب في 1800g لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين الأنابيب المجمعة لمدة تصل إلى أربع ساعات ثم معالجتها في وقت واحد. ارجع إلى الفيديو التكميلي 1 للحصول على عرض توضيحي لكيفية تشغيل أجهزة الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على وسط تدرج الكثافة ، ستكون البلازما و PBMCs أعلى من وسط تدرج الكثافة.
سوف تستقر كريات الدم الحمراء والمحببة في القاع. ارجع إلى الشكل 1 أ للحصول على تصور. بعد الطرد المركزي ، افتح بعناية أنبوب الطرد المركزي المتدرج الكثافة.
استخدم ماصة نقل لإزالة وتجاهل الطبقة الصفراء الشفافة التي تحتوي على البلازما. لا تزعج الطبقة الضبابية من الخلايا مباشرة فوق وسط تدرج الكثافة. يخطئ في جانب ترك البلازما الزائدة بدلا من التخلص من PBMCs.
كرر لجميع الأنابيب. مع ماصة نقل جديدة ، ماصة الحجم المتبقي الذي يحتوي على الخلايا والبلازما المتبقية في كل أنبوب صعودا وهبوطا بلطف عدة مرات فوق وسط تدرج الكثافة. بعد التعليق ، ماصة محتويات الأنبوب المعاد تعليقها في أنبوب مخروطي 50 مل مسمى.
كرر لجميع الأنابيب. املأ الأنبوب سعة 50 مل حتى خط 50 مل بالمحلول 1 بالسكب. الطرد المركزي أنبوب 50 مل في 300g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
قد يتم إكمال بروتوكول جمع البلازما وبافي المفصل في القسم 2 خلال هذا الوقت. بعد الطرد المركزي ، تحتوي الحبيبات على PBMCs ويحتوي الطافي على الصفائح الدموية والبلازما المتبقية. تخلص من أكبر قدر ممكن من المواد الطافية.
اضغط حسب الحاجة لإزالة القطرات المتبقية. صب أنبوبا سعة 15 مل من المحلول 2 في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل الذي يحتوي على حبيبات PBMC. اقلب الأنبوب برفق لإعادة تعليق الحبيبة.
نضح 15 مل من المحلول 3 باستخدام ماصة نقل. أضف قطرة قطرة إلى أنبوب 50 مل. يحتوي المحلول 3 على DMSO ، وهو سام للخلايا في درجة حرارة الغرفة.
لا تقم بإضافة المحلول 3 حتى يصبح جاهزا للمعالجة على الفور. اقلب الأنبوب برفق ثلاث مرات للخلط. املأ كل قارورة تبريد مصنفة مسبقا ومبردة مسبقا ب 1 مل من PBMCs باستخدام ماصة متعددة الاستغناء.
ارجع إلى الفيديو التكميلي 2 للحصول على عرض توضيحي لكيفية تشغيل ماصة متعددة التوزيع. ضع قوارير التبريد داخل حاوية تجميد مبردة مسبقا. ثم انقل الحاوية إلى مجمد سالب 80 درجة مئوية.
احتفظ بقوارير التبريد داخل حاوية التجميد لمدة لا تقل عن 12 ساعة. بعد ذلك ، انقله إلى صندوق تخزين مكتوب عليه عند سالب 80 درجة سلزية. بدلا من ذلك ، انقل قوارير التبريد المجمدة إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.
بعد الطرد المركزي ، تتكون الطبقة العليا من البلازما ، ويحتوي الجزء السفلي على كريات الدم الحمراء ، وستكون الواجهة هي المعاطف الباهتة. انظر الشكل 1B للحصول على تصور. باستخدام ماصة نقل جديدة ، ارسم أكبر قدر ممكن من البلازما دون إزعاج طبقة معطف بافي.
بعد ذلك ، قم بتوزيع 0.5 مل من القسمة في قوارير التبريد المصنفة مسبقا. قم بشفط طبقة المعطف المصفر ونقلها إلى قارورة التبريد ذات العلامات المناسبة. لاحظ أن بعض البلازما وكريات الدم الحمراء قد تلوث مجموعة معطف بافي.
بعد التجميع ، قم بتخزين قوارير التبريد في فريزر سالب 80 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، قم بتخزينه في النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل. قبل البدء في بروتوكول ذوبان PBMC ، يرجى إعداد المواد والكواشف المدرجة في الجدول 3.
تم تصميم هذا البروتوكول لإذابة أنبوب واحد سعة 1.5 مل يحتوي على ما يقرب من 2 مليون خلية. مقياس وفقا لذلك. لاحظ أن العدد المطلق للخلايا قد يختلف اختلافا كبيرا بين المرضى المختلفين وظروف العلاج المختلفة.
انقل PBMCs المجمدة من التخزين باستخدام الثلج الجاف وقم بالذوبان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق تقريبا. إذا رغبت في ذلك ، يمكن أخذ حصة لعد الخلايا وقياسات الجدوى كما هو مفصل في القسم 4 من البروتوكول المكتوب. بعد الذوبان ، أضف 1 مل من المحلول 4 إلى كل قارورة تبريد.
بعد ذلك ، صب المحتويات في أنبوب 50 مل المسمى مسبقا يحتوي على 10 مل من المحلول 4 لكل أنبوب PBMC مذاب. انقر لإزالة القطرات المتبقية. ضع مصفاة الخلية على أنبوب فارغ سعة 50 مل ثم صب تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية.
إذا لزم الأمر ، اضغط برفق لكسر التوتر السطحي. جهاز طرد مركزي يحتوي على كل أنبوب يحتوي على الخلايا المتوترة عند 400 جرام لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، اسكب المادة الطافية التي تحتوي على DMSO.
اضغط حسب الحاجة لإزالة القطرات المتبقية. أعد تعليق حبيبات الخلية في الوسط المطلوب المناسب للاحتياجات التجريبية النهائية ، مثل وسائط زراعة الخلايا أو كوكتيلات الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي. تابع تجربتك.
بعد جمع PBMC والحفظ بالتبريد ، تم تقييم صلاحية PBMCs المذابة ، وحيدات ، والخلايا الليمفاوية من 56 عينة فريدة من خلال قياس التدفق الخلوي باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 4 باتباع تعليمات الشركة المصنعة الموضحة في الأشكال من 2A إلى F.A متوسط وصلاحية الانحراف المعياري ل PBMCs ، وحيدات ، والخلايا الليمفاوية من 94 زائد أو ناقص 4٪ 98 زائد أو ناقص 1.1٪ و 93 زائد أو ناقص 5.6٪ على التوالي ، ، كما هو موضح في الشكل 2G. أسفرت قياسات الجدوى عن طريق استبعاد تريبان الأزرق عن متوسط صلاحية 88 زائد أو ناقص 7.5٪ وعدد خلايا 2.3 في 10 إلى 6 زائد أو ناقص 1.9 في 10 إلى 6. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أيضا أن الخلايا الوحيدة الحية تتكون من 17 زائد أو ناقص 5.9٪ والخلايا الليمفاوية تتكون من 53 زائد أو ناقص 13٪ من إجمالي PBMCs.
بعد ذلك ، تم فرز الخلايا الوحيدة من PBMCs المذابة من 59 عينة فريدة عن طريق قياس التدفق الخلوي وتقديمها لإعداد المكتبة وتسلسل الحمض النووي الريبي كما هو موضح في مكان آخر. تم تحقيق متوسط وانحراف معياري إجمالي عدد تسلسل 18 زائد أو ناقص 16.3 مليون مع محاذاة قراءة 93 زائد أو ناقص 6.3٪ و 49.6 زائد أو ناقص 1.4 GC المحتوى كما هو موضح في الشكلين 3A و B.A متوسط والانحراف المعياري المعين بشكل فريد نسبة قراءات 88 زائد أو ناقص 3.6٪ مع مجموعة فرعية من 56 عينة فريدة. توضح هذه المعلمات أنه يمكن الحصول على PBMCs عالية الجدوى والمناسبة للتطبيقات النهائية بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الجودة من قبل المشغلين الذين لديهم أي مستوى من التدريب المختبري باستخدام هذا البروتوكول.
عند تنفيذ هذا البروتوكول ، من الأهمية بمكان العمل بسرعة لتجنب موت الخلايا ، خاصة بعد إضافة المحلول 3 ، وهو سام للخلايا في درجة حرارة الغرفة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أيضا التعامل مع الخلايا برفق لتقليل الضرر. يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة وسهلة المتابعة لعزل PBMCs وبلازما EDTA ومعطف بافي.
يمكن استخدام هذه الخلايا المناعية في مجموعة واسعة من التجارب والفحوصات التي تركز على دور الجهاز المناعي في سياقات بيولوجية مختلفة.
