In questo protocollo, miriamo a fornire un tutorial passo-passo facile da seguire su come raccogliere e conservare sangue periferico ad alta vitalità e cellule mononucleate, o PBMC, da sangue intero. Le PBMC includono linfociti, cellule dendritiche e monociti. Le PBMC bulk possono essere elaborate per isolare singoli tipi di cellule e sono comunemente utilizzate in un'ampia varietà di esperimenti e saggi, tra cui il sequenziamento dell'RNA e la citometria a flusso.
Oltre alle PBMC, dimostriamo anche come raccogliere il plasma EDTA e l'intero buffy coat. Prima di iniziare questo protocollo, preparare i materiali e i reagenti elencati nella Tabella 2. Si noti che questo protocollo è progettato per la raccolta di PBMC da sei provette per centrifugazione a gradiente di densità, ciascuna delle quali produce circa 12 milioni di cellule.
Scala di conseguenza. Utilizzando la tecnica standard di flebotomia, raccogliere il sangue intero in sei provette per centrifugazione a gradiente di densità e una provetta EDTA fino al riempimento. Centrifugare tutte le provette a 1800 g per 20 minuti a temperatura ambiente.
Se necessario, le provette raccolte possono essere conservate fino a quattro ore e poi lavorate contemporaneamente. Fare riferimento al video supplementare 1 per una dimostrazione di come utilizzare una centrifuga. Dopo la centrifugazione della provetta contenente il mezzo a gradiente di densità, il plasma e le PBMC saranno al di sopra del mezzo a gradiente di densità.
Gli eritrociti e i granulociti si depositeranno sul fondo. Fare riferimento alla Figura 1A per una visualizzazione. Dopo la centrifugazione, aprire con cautela la provetta per centrifugazione a gradiente di densità.
Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere ed eliminare lo strato giallo traslucido contenente plasma. Non disturbare lo strato nebuloso di celle direttamente sopra il mezzo del gradiente di densità. Sbaglia per eccesso di plasma piuttosto che scartare le PBMC.
Ripetere per tutte le provette. Con una nuova pipetta di trasferimento, pipettare delicatamente su e giù il volume rimanente contenente le cellule e il plasma residuo in ciascuna provetta più volte al di sopra del mezzo di gradiente di densità. Dopo la risospensione, pipettare il contenuto risospeso della provetta in una provetta conica da 50 mL etichettata.
Ripetere per tutte le provette. Riempire la provetta da 50 mL fino alla linea da 50 mL con la soluzione 1 versando. Centrifugare la provetta da 50 mL a 300 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
Il protocollo di raccolta del plasma e del buffy descritto nella Sezione 2 può essere completato durante questo periodo. Dopo la centrifugazione, il pellet contiene PBMC e il surnatante contiene piastrine e plasma residuo. Scartare quanto più surnatante possibile.
Toccare secondo necessità per rimuovere le gocce residue. Versare una provetta da 15 mL di soluzione 2 nella provetta conica da 50 mL contenente il pellet di PBMC. Capovolgere delicatamente il tubo per risospendere il pellet.
Aspirare 15 mL di soluzione 3 utilizzando una pipetta di trasferimento. Aggiungere goccia a goccia alla provetta da 50 mL. La soluzione 3 contiene DMSO, che è tossico per le cellule a temperatura ambiente.
Non aggiungere la soluzione 3 fino al momento di essere immediatamente lavorata. Capovolgere delicatamente il tubo tre volte per mescolare. Riempire ogni fiala criogenica pre-etichettata e pre-raffreddata con 1 mL di PBMC utilizzando una pipetta multi-dispense.
Fare riferimento al video supplementare 2 per una dimostrazione di come utilizzare una pipetta a dispensazione multipla. Posizionare le fiale criogeniche all'interno di un contenitore di congelamento pre-refrigerato. Quindi, sposta il contenitore in un congelatore a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.
Conservare le fiale criogeniche all'interno del contenitore di congelamento per un minimo di 12 ore. Quindi, trasferisci in una scatola di immagazzinaggio etichettata a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. In alternativa, trasferire le fiale criogeniche congelate in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
Dopo la centrifugazione, lo strato superiore è costituito da plasma, il fondo contiene eritrociti e l'interfaccia sarà costituita dai buffy coat. Vedere la Figura 1B per una visualizzazione. Utilizzando una nuova pipetta di trasferimento, aspirare quanto più plasma possibile senza disturbare lo strato di buffy coat.
Quindi, erogare 0,5 ml di aliquote in fiale criogeniche pre-marcate. Aspirare lo strato di buffy coat e trasferirlo nella fiala criogenica opportunamente etichettata. Si noti che alcuni plasma ed eritrociti possono contaminare la collezione di buffy coat.
Dopo la raccolta, conservare le fiale criogeniche in un congelatore a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. In alternativa, conservare in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Prima di iniziare il protocollo di scongelamento PBMC, preparare i materiali e i reagenti elencati nella Tabella 3.
Questo protocollo è progettato per lo scongelamento di una provetta da 1,5 mL contenente circa 2 milioni di cellule. Scala di conseguenza. Si noti che il numero assoluto di cellule può differire in modo significativo tra i diversi pazienti e le diverse condizioni di trattamento.
Trasferire le PBMC congelate dal deposito utilizzando ghiaccio secco e scongelarle in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per circa 4 minuti. Se lo si desidera, è possibile prelevare un'aliquota per il conteggio delle cellule e le misurazioni della vitalità, come descritto nella sezione 4 del protocollo scritto. Dopo lo scongelamento, aggiungere 1 mL di soluzione 4 a ciascuna fiala criogenica.
Quindi, versare il contenuto in una provetta da 50 ml pre-marcata contenente 10 ml di soluzione 4 per ogni provetta PBMC scongelata. Tocca per rimuovere le gocce residue. Posizionare il filtro cellulare sulla provetta vuota da 50 mL, quindi versare la sospensione cellulare attraverso il filtro cellulare.
Se necessario, picchiettare leggermente per interrompere la tensione superficiale. Centrifugare ogni provetta contenente le cellule filtrate a 400 g per 7 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, versare il surnatante contenente DMSO.
Toccare secondo necessità per rimuovere le gocce residue. Risospendere il pellet cellulare nel terreno desiderato per le esigenze sperimentali a valle, come i terreni di coltura cellulare o i cocktail di anticorpi per citometria a flusso. Procedi con l'esperimento.
Dopo la raccolta e la crioconservazione delle PBMC, la vitalità di PBMC, monociti e linfociti scongelati da 56 campioni unici è stata valutata mediante citometria a flusso utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 4 seguendo le istruzioni del produttore mostrate nelle Figure 2A fino alla media F.A e la vitalità della deviazione standard di PBMC, monociti e linfociti di 94 più o meno il 4%98 più o meno l'1,1% e 93 più o meno il 5,6% rispettivamente, è stato raggiunto, illustrato nella Figura 2G. Le misurazioni della vitalità mediante esclusione del blu di tripano hanno prodotto una vitalità media di 88 più o meno il 7,5% e una conta cellulare di 2,3 volte 10 a 6 più o meno 1,9 volte 10 a 6. L'analisi della citometria a flusso ha anche dimostrato che i monociti vivi costituivano 17 più o meno il 5,9% e i linfociti costituivano 53 più o meno il 13% del totale delle PBMC.
Successivamente, i monociti sono stati selezionati da PBMC scongelati da 59 campioni unici mediante citometria a flusso e inviati per la preparazione della libreria e il sequenziamento dell'RNA come descritto altrove. Un conteggio totale della sequenza media e della deviazione standard di 18 più o meno 16,3 milioni è stato raggiunto con un allineamento di 93 più o meno il 6,3% di lettura e 49,6 più o meno 1,4 GC come mostrato nelle Figure 3A e B.A media e deviazione standard mappata in modo univoco la percentuale di letture di 88 più o meno il 3,6% è stata trovata con un sottoinsieme di 56 campioni unici. Questi parametri dimostrano che PBMC altamente vitali adatte per applicazioni a valle, incluso il sequenziamento dell'RNA di alta qualità, possono essere ottenute da operatori con qualsiasi livello di formazione di laboratorio utilizzando questo protocollo.
Quando si esegue questo protocollo, è fondamentale lavorare rapidamente per evitare la morte cellulare, soprattutto dopo l'aggiunta della soluzione 3, che è tossica per le cellule a temperatura ambiente. Inoltre, le celle devono essere maneggiate delicatamente per ridurre al minimo i danni. Questo protocollo fornisce un metodo efficiente e facile da seguire per l'isolamento di PBMC, plasma EDTA e buffy coat.
Queste cellule immunitarie possono essere utilizzate per un'ampia gamma di esperimenti e saggi incentrati sul ruolo del sistema immunitario in diversi contesti biologici.
