このプロトコルでは、全血から高生存率の末梢血および単核細胞(PBMC)を収集し保存する方法について、わかりやすいステップバイステップのチュートリアルを提供することを目指しています。PBMCには、リンパ球、樹状細胞、および単球が含まれます。バルクPBMCは、個々の細胞タイプを分離するために処理することができ、RNAシーケンシングやフローサイトメトリーなど、さまざまな実験やアッセイで一般的に使用されています。
PBMCに加えて、EDTAプラズマとバフィーコート全体の収集方法も示します。このプロトコールを開始する前に、表2に記載されている材料と試薬を準備してください。このプロトコルは、6本の密度勾配遠心分離チューブからPBMCを採取するために設計されており、各チューブは約1,200万個の細胞を生成します。
それに応じてスケーリングします。標準的な瀉血技術を使用して、6本の密度勾配遠心分離チューブと1本のEDTAチューブに全血を充填するまで集めます。すべてのチューブを1800gで室温で20分間遠心分離します。
必要に応じて、回収したチューブを最大4時間保存し、同時に処理することができます。遠心分離機の操作方法のデモンストレーションについては、補足ビデオ1を参照してください。密度勾配媒体を含むチューブを遠心分離した後、プラズマとPBMCは密度勾配媒体より上になります。
赤血球と顆粒球は底に落ち着きます。視覚化については、図 1A を参照してください。遠心分離後、密度勾配遠心分離チューブを慎重に開きます。
トランスファーピペットを使用して、血漿を含む半透明の黄色の層を除去および廃棄します。密度勾配培地の真上にある細胞のかすんだ層を乱さないでください。PBMCを捨てるのではなく、余分なプラズマを残す側で過ちを犯します。
すべてのチューブに対して繰り返します。新しいトランスファーピペットを使用して、各チューブ内の細胞と残留血漿を含む残りの容量を、密度勾配培地の上で緩やかに数倍上下にピペットします。再懸濁後、再懸濁したチューブの内容物をラベル付きの50mLコニカルチューブにピペットで移します。
すべてのチューブに対して繰り返します。50 mLチューブを50 mLラインまで注ぎ、溶液1を注ぎます。50 mLチューブを300 gで室温で10分間遠心分離します。
セクション2で詳述されている血漿およびバフィー収集プロトコルは、この期間中に完了することができます。遠心分離後、ペレットにはPBMCが含まれ、上清には血小板と残留血漿が含まれます。できるだけ多くの上清を捨てます。
必要に応じてタップして、残留液滴を取り除きます。15 mLのチューブに溶液2を注ぎ、PBMCペレットが入った50 mLのコニカルチューブに注ぎます。チューブを静かに反転させて、ペレットを再懸濁します。
トランスファーピペットを使用して溶液315 mLを吸引します。50mLチューブに滴下します。溶液3には、室温で細胞に毒性のあるDMSOが含まれています。
すぐに処理する準備ができるまで、ソリューション 3 を追加しないでください。チューブを3回静かに反転させて混ぜます。事前に標識および冷却した各クライオバイアルに、マルチディスペンスピペットを使用して1 mLのPBMCを充填します。
マルチディスペンスピペットの操作方法のデモンストレーションについては、補足ビデオ2を参照してください。クライオバイアルを事前に冷却した冷凍容器に入れます。次に、容器をマイナス80°Cの冷凍庫に移動します。
クライオバイアルを冷凍容器内に最低12時間保管します。次に、マイナス80°Cのラベル付き収納ボックスに移します。あるいは、凍結したクライオバイアルを液体窒素に移して長期保存します。
遠心分離後、最上層は血漿で構成され、下層は赤血球を含み、界面はバフィーコートになります。視覚化については、図 1B を参照してください。新しいトランスファーピペットを使用して、バフィーコート層を乱さずにできるだけ多くのプラズマを吸い上げます。
次に、0.5 mL のアリコートを標識済みのクライオバイアルに分注します。バフィーコート層を吸引し、適切に標識されたクライオバイアルに移します。一部の血漿および赤血球がバフィーコートコレクションを汚染する可能性があることに注意してください。.
収集後、クライオバイアルをマイナス80°Cの冷凍庫に保管します。あるいは、液体窒素で保存して長期保存することもできます。PBMC解凍プロトコルを開始する前に、表3に記載されている材料と試薬を準備してください。
このプロトコールは、約200万個の細胞を含む1.5mLのチューブ1本を解凍するために設計されています。それに応じてスケーリングします。細胞の絶対数は、患者や治療条件によって大きく異なる場合があることに注意してください。
凍結したPBMCをドライアイスで保存から移し、37°Cのインキュベーターで約4分間解凍します。所望であれば、書面によるプロトコルのセクション4に詳述されているように、細胞カウントおよび生存率測定のためにアリコートを採取することができる。解凍後、各クライオバイアルに1 mLの溶液4を加えます。
次に、PBMCチューブを解凍するごとに10 mLの溶液4が入った標識済みの50 mLチューブに内容物を注ぎます。タップして残留液滴を取り除きます。空の50mLチューブにセルストレーナーを置き、セルストレーナーに細胞懸濁液を注ぎます。
必要に応じて、軽くたたいて表面張力を解きます。菌株細胞を含む各チューブを400gで室温で7分間遠心分離します。遠心分離後、DMSOを含む上清を注ぎます。
必要に応じてタップして、残留液滴を取り除きます。細胞ペレットを、細胞培養培地やフローサイトメトリー抗体カクテルなどの下流の実験ニーズに適した目的の培地に再懸濁します。実験を続行します。
PBMCの収集および凍結保存に続いて、56のユニークなサンプルからの解凍されたPBMC、単球、およびリンパ球の生存率を、図2Aに示す製造元の指示に従って表4にリストされている試薬を使用してフローサイトメトリーによって評価しました。 図2Gに示すように達成されました。トリパンブルー排除による生存率の測定により、平均生存率は88±7.5%、細胞数は10の2.3倍から6倍、10のプラスマイナス1.9倍から6の細胞数が得られました。フローサイトメトリー解析では、生単球が17のプラスマイナス5.9%、リンパ球が53プラスマイナス13%で構成されていることも示されました。
その後、59のユニークなサンプルから解凍したPBMCから単球をフローサイトメトリーで選別し、他の場所で説明したように、ライブラリ調製とRNAシーケンシングに提出しました。図 3A に示すように、平均および標準偏差の合計シーケンス数は 18 プラスマイナス 1,630 万で、93 プラスマイナス 6.3% のリードアライメントと 49.6 プラスマイナス 1.4 の GC 含量が達成されました。56 のユニークサンプルのサブセットで、平均および標準偏差のユニークマッピングリードの割合は 88 プラスマイナス 3.6% でした。これらのパラメータは、このプロトコルを使用して、あらゆるレベルのラボトレーニングを受けたオペレーターが、高品質のRNAシーケンシングを含むダウンストリームアプリケーションに適した非常に生存性の高いPBMCを取得できることを示しています。
このプロトコールを実施する際には、特に室温で細胞に毒性のある溶液3を添加した後は、細胞死を避けるために迅速に作業することが重要です。さらに、損傷を最小限に抑えるために、セルも優しく取り扱う必要があります。このプロトコルは、PBMC、EDTAプラズマ、およびバフィーコートを単離するための効率的でわかりやすい方法を提供します。
これらの免疫細胞は、さまざまな生物学的状況における免疫系の役割に焦点を当てた幅広い実験やアッセイに使用できます。
