En este protocolo, nuestro objetivo es proporcionar un tutorial paso a paso fácil de seguir sobre cómo recolectar y almacenar células mononucleares y de sangre periférica de alta viabilidad, o PBMC, de sangre completa. Las PBMC incluyen linfocitos, células dendríticas y monocitos. Las PBMC a granel se pueden procesar para aislar tipos de células individuales y se utilizan comúnmente en una amplia variedad de experimentos y ensayos, incluida la secuenciación de ARN y la citometría de flujo.
Además de los PBMC, también demostramos cómo recolectar plasma EDTA y capa leucocitaria completa. Antes de comenzar este protocolo, prepare los materiales y reactivos enumerados en la Tabla 2. Tenga en cuenta que este protocolo está diseñado para la recolección de PBMC de seis tubos de centrifugación en gradiente de densidad, cada uno de los cuales produce aproximadamente 12 millones de células.
Escale en consecuencia. Usando la técnica estándar de flebotomía, recoja sangre completa en seis tubos de centrifugación en gradiente de densidad y un tubo de EDTA hasta que se llene. Centrifugar todos los tubos a 1800 g durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Si es necesario, los tubos recolectados pueden almacenarse hasta cuatro horas y luego procesarse simultáneamente. Consulte el video complementario 1 para ver una demostración de cómo operar una centrífuga. Después de la centrifugación del tubo que contiene el medio de gradiente de densidad, el plasma y los PBMC estarán por encima del medio de gradiente de densidad.
Los eritrocitos y granulocitos se asentarán en el fondo. Consulte la Figura 1A para obtener una visualización. Después de la centrifugación, abra con cuidado el tubo de centrifugación de gradiente de densidad.
Utilice una pipeta de transferencia para eliminar y desechar la capa amarilla translúcida que contiene plasma. No moleste la capa nebulosa de células directamente sobre el medio de gradiente de densidad. Opta por dejar el exceso de plasma en lugar de descartar las PBMC.
Repita para todos los tubos. Con una nueva pipeta de transferencia, pipetee suavemente el volumen restante que contiene células y plasma residual en cada tubo varias veces por encima del medio de gradiente de densidad. Después de la resuspensión, pipetee el contenido resuspendido del tubo en un tubo cónico de 50 ml etiquetado.
Repita para todos los tubos. Llene el tubo de 50 mL hasta la línea de 50 mL con la solución 1 vertiendo. Centrifugar el tubo de 50 ml a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
El protocolo de recolección de plasma y leucemia detallado en la Sección 2 puede completarse durante este tiempo. Después de la centrifugación, el gránulo contiene PBMC y el sobrenadante contiene plaquetas y plasma residual. Deseche la mayor cantidad posible de sobrenadante.
Golpee según sea necesario para eliminar las gotas residuales. Vierta un tubo de 15 mL de solución 2 en el tubo cónico de 50 mL que contiene el pellet de PBMC. Invierta suavemente el tubo para volver a suspender el pellet.
Aspire 15 mL de solución 3 con una pipeta de transferencia. Agregue gota a gota al tubo de 50 ml. La solución 3 contiene DMSO, que es tóxico para las células a temperatura ambiente.
No agregue la solución 3 hasta que esté lista para ser procesada inmediatamente. Invierta el tubo suavemente tres veces para mezclar. Llene cada vial criogénico preetiquetado y preenfriado con 1 ml de PBMC utilizando una pipeta de dispensación múltiple.
Consulte el vídeo complementario 2 para ver una demostración de cómo utilizar una pipeta multidosificación. Coloque los viales criogénicos dentro de un recipiente de congelación preenfriado. Luego, mueva el recipiente a un congelador de 80 grados centígrados negativos.
Mantenga los viales criogénicos dentro del recipiente de congelación durante un mínimo de 12 horas. Luego, transfiéralo a una caja de almacenamiento etiquetada a menos 80 grados centígrados. Alternativamente, transfiera los viales criogénicos congelados a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
Después de la centrifugación, la capa superior consiste en plasma, la inferior contiene eritrocitos y la interfaz serán las capas leucocitarias. Consulte la Figura 1B para ver una visualización. Con una pipeta de transferencia nueva, extraiga la mayor cantidad de plasma posible sin alterar la capa de capa leucocitaria.
A continuación, dispense alícuotas de 0,5 ml en viales criogénicos preetiquetados. Aspire la capa de capa leucocitaria y transfiérala al vial criogénico debidamente etiquetado. Tenga en cuenta que parte del plasma y los eritrocitos pueden contaminar la colección de pelaje leucocitario.
Después de la recolección, almacene los viales criogénicos en un congelador a 80 grados centígrados negativos. Alternativamente, almacene nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. Antes de iniciar el protocolo de descongelación de PBMC, prepare los materiales y reactivos enumerados en la Tabla 3.
Este protocolo está diseñado para la descongelación de un tubo de 1,5 mL que contiene aproximadamente 2 millones de células. Escale en consecuencia. Tenga en cuenta que el número absoluto de células puede diferir significativamente entre los diferentes pacientes y las diferentes condiciones de tratamiento.
Transfiera los PBMC congelados del almacenamiento con hielo seco y descongele en una incubadora a 37 grados centígrados durante unos 4 minutos. Si se desea, se puede tomar una alícuota para el recuento de células y las mediciones de viabilidad, como se detalla en la sección 4 del protocolo escrito. Después de descongelar, agregue 1 ml de solución 4 a cada vial criogénico.
Luego, vierta el contenido en un tubo preetiquetado de 50 mL que contiene 10 mL de solución 4 por cada tubo de PBMC descongelado. Toque para eliminar las gotas residuales. Coloque el filtro de células en el tubo vacío de 50 ml y luego vierta la suspensión de células a través del filtro de células.
Si es necesario, golpee ligeramente para romper la tensión superficial. Centrifugar cada tubo que contiene las células coladas a 400 g durante 7 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, vierta el sobrenadante que contiene DMSO.
Golpee según sea necesario para eliminar las gotas residuales. Vuelva a suspender el gránulo celular en el medio deseado adecuado para las necesidades experimentales posteriores, como medios de cultivo celular o cócteles de anticuerpos de citometría de flujo. Continúe con su experimento.
Después de la recolección y criopreservación de PBMC, se evaluó la viabilidad de PBMC, monocitos y linfocitos descongelados de 56 muestras únicas mediante citometría de flujo utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 4 siguiendo las instrucciones del fabricante que se muestran en las Figuras 2A a F.A viabilidad media y desviada estándar de PBMC, monocitos y linfocitos de 94 más o menos 4%98 más o menos 1,1% y 93 más o menos 5,6% respectivamente, se logró, como se muestra en la Figura 2G. Las mediciones de viabilidad por exclusión de azul de tripano arrojaron una viabilidad media de 88 más o menos 7,5% y un recuento de células de 2,3 veces 10 a 6, más o menos 1,9 veces 10 a 6. El análisis de citometría de flujo también demostró que los monocitos vivos comprendían 17 más o menos el 5,9% y los linfocitos componían 53 más o menos el 13% del total de PBMC.
Posteriormente, los monocitos se clasificaron a partir de PBMC descongelados de 59 muestras únicas mediante citometría de flujo y se enviaron para la preparación de la biblioteca y la secuenciación del ARN, como se describe en otra parte. Se logró una media y desviación estándar del recuento total de secuencias de 18 más o menos 16,3 millones, con un 93 más o menos 6,3% de alineación de lectura y 49,6 más o menos 1,4 de contenido de GC, como se muestra en las Figuras 3A y B.Se encontró un porcentaje de lecturas mapeadas de 88 más o menos 3,6% con un subconjunto de 56 muestras únicas. Estos parámetros demuestran que los operadores con cualquier nivel de formación de laboratorio pueden obtener PBMC altamente viables y adecuados para aplicaciones posteriores, incluida la secuenciación de ARN de alta calidad, utilizando este protocolo.
Al realizar este protocolo, es fundamental trabajar rápidamente para evitar la muerte celular, especialmente después de la adición de la solución 3, que es tóxica para las células a temperatura ambiente. Además, las celdas también deben manipularse con cuidado para minimizar el daño. Este protocolo proporciona un método eficiente y fácil de seguir para el aislamiento de PBMC, plasma EDTA y capa leucocitaria.
Estas células inmunitarias pueden utilizarse para una amplia gama de experimentos y ensayos centrados en el papel del sistema inmunitario en diferentes contextos biológicos.
