בפרוטוקול זה, אנו שואפים לספק הדרכה קלה למעקב, שלב אחר שלב, כיצד לאסוף ולאחסן דם היקפי בעל כדאיות גבוהה ותאים חד-גרעיניים, או PBMCs, מדם שלם. PBMCs כוללים לימפוציטים, תאים דנדריטיים ומונוציטים. PBMCs בתפזורת יכולים להיות מעובדים כדי לבודד סוגי תאים בודדים והם משמשים בדרך כלל במגוון רחב של ניסויים ומבחנים, כולל ריצוף RNA וציטומטריית זרימה.
בנוסף PBMCs, אנו גם להדגים כיצד לאסוף פלזמה EDTA ומעיל באפי שלם. לפני תחילת פרוטוקול זה, אנא הכינו את החומרים והריאגנטים המפורטים בטבלה 2. שימו לב שפרוטוקול זה מיועד לאיסוף PBMCs משישה צינורות צנטריפוגה הדרגתיים בצפיפות, שכל אחד מהם מניב כ-12 מיליון תאים.
התרחב בהתאם. באמצעות טכניקת פלבוטומיה סטנדרטית, יש לאסוף דם שלם בשישה צינורות צנטריפוגה הדרגתיים בצפיפות וצינור EDTA אחד עד למילוי. צנטריפוגה כל הצינורות ב 1800 גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
במידת הצורך, ניתן לאחסן את הצינורות שנאספו עד ארבע שעות ולאחר מכן לעבד אותם בו זמנית. עיין בסרטון המשלים 1 להדגמה כיצד להפעיל צנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה של הצינור המכיל את תווך שיפוע הצפיפות, פלזמה ו- PBMCs יהיו מעל תווך שיפוע הצפיפות.
אריתרוציטים וגרנולוציטים ישקעו לתחתית. עיינו באיור 1A להמחשה. לאחר הצנטריפוגה, פתח בזהירות את צינור הצנטריפוגה שיפוע הצפיפות.
השתמש פיפטה העברה כדי להסיר ולהשליך את השכבה הצהובה השקופה המכילה פלזמה. אין להפריע לשכבת התאים המעורפלת ישירות מעל מדיום שיפוע הצפיפות. לטעות בצד של השארת פלזמה עודפת במקום להשליך PBMCs.
חזור על הפעולה עבור כל הצינורות. עם פיפטת העברה חדשה, פיפטה את הנפח הנותר המכיל תאים ושאריות פלזמה בכל צינור למעלה ולמטה בעדינות מספר פעמים מעל מדיום שיפוע הצפיפות. לאחר ההשעיה, פיפטה את התוכן resuspended של הצינור לתוך צינור חרוטי מסומן 50 מ"ל.
חזור על הפעולה עבור כל הצינורות. מלא את הצינור 50 מ"ל עד קו 50 מ"ל עם פתרון 1 על ידי מזיגה. צנטריפוגה את הצינור 50 מ"ל ב 300 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
פרוטוקול איסוף הפלזמה והבאפי המפורט בסעיף 2 עשוי להסתיים במהלך תקופה זו. לאחר הצנטריפוגה, הגלולה מכילה PBMCs והסופרנאטנט מכיל טסיות דם ושאריות פלזמה. השליכו כמה שיותר סופרנאטנט.
יש ללחוץ לפי הצורך כדי להסיר שאריות טיפות. יוצקים צינור 15 מ"ל של תמיסה 2 לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל את גלולת PBMC. הפוך בעדינות את הצינור כדי להשהות מחדש את הכדור.
לשאוף 15 מ"ל של פתרון 3 באמצעות פיפטה העברה. הוסף טיפה לצינור 50 מ"ל. תמיסה 3 מכילה DMSO, שהוא רעיל לתאים בטמפרטורת החדר.
אל תוסיף פתרון 3 עד שהוא מוכן לעיבוד מיידי. הפכו את הצינור בעדינות שלוש פעמים כדי לערבב. מלאו כל בקבוקון קריו מסומן מראש ומקורר מראש ב-1 מ"ל PBMCs באמצעות פיפטה מרובת מנותקים.
עיין בסרטון המשלים 2 להדגמה כיצד להפעיל פיפטה מרובת שירותים. הניחו את בקבוקוני הקריו בתוך מיכל הקפאה מקורר מראש. לאחר מכן, העבירו את המיכל למקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס.
שמור את בקבוקוני ההקפאה בתוך מיכל ההקפאה למשך 12 שעות לפחות. לאחר מכן, העבירו לקופסת אחסון עם תווית בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. לחלופין, העבירו את בקבוקוני הקריו הקפואים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
לאחר צנטריפוגה, השכבה העליונה מורכבת פלזמה, התחתון מכיל אריתרוציטים, ואת הממשק יהיה מעילים באפי. ראו איור 1B להמחשה. בעזרת פיפטת העברה חדשה, ציירו כמה שיותר פלזמה מבלי להפריע לשכבת הפרווה הבאפי.
לאחר מכן, יש לפזר 0.5 מ"ל aliquots לתוך בקבוקוני cryo מסומנים מראש. שאפו את שכבת הפרווה הבאפית והעבירו אותה לבקבוקון הקריו המסומן כראוי. שים לב כי כמה פלזמה אריתרוציטים עלולים לזהם את אוסף מעיל באפי.
לאחר האיסוף, אחסנו את בקבוקוני הקריו במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס. לחלופין, יש לאחסן בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. לפני תחילת פרוטוקול ההפשרה של PBMC, אנא הכינו את החומרים והריאגנטים המפורטים בטבלה 3.
פרוטוקול זה מיועד להפשרה של צינור אחד בנפח 1.5 מ"ל המכיל כ-2 מיליון תאים. התרחב בהתאם. שימו לב שהמספר האבסולוטי של התאים עשוי להיות שונה באופן משמעותי בין מטופלים שונים ומצבי טיפול שונים.
מעבירים מרכזיות קפואות מהאחסון באמצעות קרח יבש ומפשירים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-4 דקות. אם תרצה, ניתן לקחת aliquot עבור ספירת תאים ומדידות כדאיות כמפורט בסעיף 4 של הפרוטוקול הכתוב. לאחר ההפשרה, הוסף 1 מ"ל של תמיסה 4 לכל בקבוקון קריו.
לאחר מכן, שפכו את התוכן לתוך צינור 50 מ"ל מסומן מראש המכיל 10 מ"ל של תמיסה 4 עבור כל צינור PBMC מופשר. הקש כדי להסיר טיפות שיורית. הניחו את מסננת התא על הצינור הריק של 50 מ"ל ולאחר מכן שפכו את תרחיף התא דרך מסננת התא.
במידת הצורך, הקש קלות כדי לשבור את מתח פני השטח. צנטריפוגה כל צינור המכיל את התאים המתוחים ב 400 גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, יוצקים החוצה את supernatant המכיל DMSO.
יש ללחוץ לפי הצורך כדי להסיר שאריות טיפות. יש להשהות מחדש את כדורית התא בתווך הרצוי המתאים לצרכים ניסיוניים במורד הזרם, כגון מדיה של תרבית תאים או קוקטיילים של נוגדנים ציטומטריית זרימה. המשך בניסוי שלך.
לאחר איסוף PBMC ושימור בהקפאה, הוערכה הכדאיות של PBMCs, מונוציטים ולימפוציטים מופשרים מ-56 דגימות ייחודיות באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות ריאגנטים המפורטים בטבלה 4 בהתאם להוראות היצרן המוצגות באיורים 2A עד F.A ממוצע וסטיית תקן של PBMCs, מונוציטים ולימפוציטים של 94 פלוס או מינוס 4%98 פלוס או מינוס 1.1% ו-93 פלוס או מינוס 5.6% בהתאמה, הושג, מוצג באיור 2G. מדידות כדאיות על ידי אי הכללת כחול טריפאן הניבו כדאיות ממוצעת של 88 פלוס או מינוס 7.5% וספירת תאים של 2.3 כפול 10 לפלוס 6 או מינוס 1.9 כפול 10 עד 6. ניתוח ציטומטריית זרימה הראה גם כי מונוציטים חיים היוו 17 פלוס או מינוס 5.9% ולימפוציטים היוו 53 פלוס או מינוס 13% מכלל PBMCs.
לאחר מכן, מונוציטים מוינו מ-PBMCs מופשרים מ-59 דגימות ייחודיות לפי ציטומטריית זרימה והוגשו להכנת ספרייה וריצוף RNA כמתואר במקום אחר. ספירת רצף כוללת ממוצעת וסטיית תקן של 18 פלוס או מינוס 16.3 מיליון הושגה עם יישור קריאה של 93 פלוס או מינוס 6.3% ותוכן קריאה של 49.6 פלוס או מינוס 1.4 GC כפי שמוצג באיורים 3A ו- B.A ממוצע וסטיית תקן שמופו באופן ייחודי אחוז קריאה של 88 פלוס או מינוס 3.6% נמצא עם תת-קבוצה של 56 דגימות ייחודיות. פרמטרים אלה מוכיחים כי PBMCs קיימא מאוד המתאימים ליישומים במורד הזרם, כולל ריצוף RNA באיכות גבוהה, ניתן להשיג על ידי מפעילים עם כל רמה של הכשרה במעבדה באמצעות פרוטוקול זה.
בעת ביצוע פרוטוקול זה, חיוני לעבוד במהירות כדי למנוע מוות תאי, במיוחד לאחר הוספת תמיסה 3, שהיא רעילה לתאים בטמפרטורת החדר. בנוסף, יש לטפל בתאים בעדינות כדי למזער נזקים. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה וקלה למעקב לבידוד PBMCs, פלזמה EDTA וציפוי באפי.
תאי חיסון אלה יכולים לשמש למגוון רחב של ניסויים ובדיקות המתמקדים בתפקידה של מערכת החיסון בהקשרים ביולוגיים שונים.
