يعترف البنك الحيوي الصحي على مستوى الولاية في نيو ساوث ويلز بامتنان بالدعم المقدم من علم الأمراض الصحية في نيو ساوث ويلز ، ومكتب نيو ساوث ويلز للبحوث الصحية والطبية ، ومنطقة سيدني الصحية المحلية. بالإضافة إلى ذلك ، يعترف المؤلفون بامتنان ب Omico والدراسات البحثية الأخرى التي يدعمها البنك الحيوي على مستوى الولاية في نيو ساوث ويلز لمنح الإذن بنشر البيانات التي تم إنشاؤها داخليا واستخدام العينات غير المستخدمة لأغراض البحث. يشكر المؤلفون البروفيسور جينيفر براين (علم الأمراض الصحية في نيو ساوث ويلز ، جامعة سيدني) على القيادة والمناقشات النقدية. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

تم الحصول على عينات الدم لمراقبة الجودة والبيانات التي تم إنشاؤها داخليا (مثل عدد الخلايا وصلاحيتها وعمر العينة عند المعالجة) من الدراسات البحثية المتفق عليها في البنك الحيوي على مستوى الولاية في نيو ساوث ويلز ، مستشفى الأمير ألفريد الملكي (موافقة HREC: 2019/ETH06776). تم جمع عينات الدم البشري للبالغين المعالجة (أي المستنفدة للبلازما) وغير المفحوصة وغير المحددة في أنابيب EDTA. تمت معالجة عينات الدم لمراقبة الجودة هذه بعد أقل من 72 ساعة من جمعها واستخدمت في تجارب عزل PBMC التي تقارن تدرج الكثافة والطرق القائمة على الخرز. للحصول على طريقة فصل تدرج الكثافة المستخدمة في النتائج التمثيلية، راجع الإجراء في الملف التكميلي 1. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة لهذه الدراسة في جدول المواد.
1. تحضير الدم الكامل
<ol><li>اقلب بلطف 10 مل من أنابيب الدم الكاملة (المغلفة بحمض الإيثيلين ديامينيترايتيك [EDTA] أو حمض سترات الدكستروز [ACD] أو هيبارين الليثيوم) 10 مرات في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>اختياري: إذا كان سيتم تخزين الدم الكامل ، فقم بقسمة في أنابيب التبريد لتخزين -80 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بطرد الأنابيب باستخدام دوار دلو متأرجح عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند 22 درجة مئوية مع تشغيل الفرامل (9 تسارع / 9 تباطؤ).</li>
</ol>2. مجموعة معطف بافي
<ol><li>بعد الطرد المركزي ، ضع العينات في خزانة السلامة البيولوجية وتحقق من الطبقات الثلاث المتميزة (كما هو موضح في الشكل 1). ملاحظة: توجد كرات الدم الحمراء في الطبقة الحمراء الداكنة السفلية لأنبوب الطرد المركزي. توجد طبقة بيضاء غير شفافة تحتوي على خلايا الدم البيضاء والصفائح الدموية فوق طبقة كرات الدم الحمراء ، والمعروفة باسم معطف بافي. الطبقة الصفراء العليا تحتوي على البلازما.</li>
	<li>اختياري: إذا كان سيتم تخزين البلازما ، فقم ببلازما القسمة في أنابيب التبريد لتخزين -80 درجة مئوية.</li>
	<li>ماصة 1 مل من معطف بافي (مادة أولية) من أنبوب دم سعة 10 مل ونقلها إلى الأنبوب المحدد والملصق في الخطوة 3.1 والخطوة 4.1 للطرق اليدوية والآلية ، على التوالي. قم بتدوير المعطف المكفوف (طبقة بيضاء غير شفافة) باستخدام طرف الماصة واجمع المعطف المنتفخ عن طريق الشفط. ملاحظة: أقل من 100 ميكرولتر من البلازما وكرات الدم الحمراء مقبولة أثناء الشفط. إذا تم جمع أنابيب دم متعددة لمشارك واحد ، يمكن تجميع المعاطف المنتفخة. ومع ذلك ، قد يؤثر هذا على تركيز الصفائح الدموية13.</li>
	<li>للمعالجة اليدوية ، انتقل إلى القسم 3. للمعالجة الآلية ، انتقل إلى القسم 4.</li>
	<li>اختياري: إذا كان سيتم تخزين كرات الدم الحمراء ، فقم بقسمة كرات الدم الحمراء في أنابيب التبريد لتخزين -80 درجة مئوية.</li>
</ol>3. تنقية PBMC - الطريقة اليدوية
ملاحظة: يمكن معالجة ما يصل إلى 8 عينات لكل حامل مغناطيس بواسطة مشغل واحد.
<ol><li>قم بتسمية 3 × 5 مل من أنابيب البوليسترين بأحرف A-C. ملاحظة: استخدم الترقيم التسلسلي في حالة إجراء أكثر من عينة واحدة ، أي 1A و 1B و 1C و 2A و 2B و 2C.</li>
	<li>أضف 60 ميكرولتر من 0.1 M EDTA (لتركيز EDTA النهائي البالغ 6 mM ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، انظر الملف التكميلي 2 للوصفة) إلى الأنبوب A الذي يحتوي على معطف بافي المنقول في الخطوة 2.3.</li>
	<li>أضف 50 ميكرولتر من أنبوب مزيج الكوكتيل (انظر جدول المواد) إلى الأنبوب A ، واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل ، واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>أضف 890 ميكرولتر من PBS إلى الأنبوب A واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل.</li>
	<li>دوامة أنبوب حبة مغناطيسية (انظر جدول المواد) لمدة 30 ثانية.</li>
	<li>أضف 50 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية إلى الأنبوب A واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل.</li>
	<li>ضع الأنبوب A على الفور في حامل المغناطيس واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بسحب تعليق الخلية المخصب بعناية في الأنبوب B ، وجمع الكسر الشفاف مع عدم وجود / الحد الأدنى (<100 ميكرولتر) كرات الدم الحمراء لاستعادة PBMC الأمثل. ملاحظة: لا تزعج الخرزات المرتبطة بالمغناطيس. يوصى باستخدام ماصة النقل.</li>
	<li>قم بإزالة الأنبوب A من حامل المغناطيس وتخلص منه.</li>
	<li>أضف حبات مغناطيسية سعة 50 ميكرولتر إلى تعليق الخلية في الأنبوب B واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل.</li>
	<li>ضع الأنبوب B على الفور في حامل المغناطيس واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>ماصة بعناية تعليق الخلية المخصب في الأنبوب C ، وجمع فقط الجزء الواضح. ملاحظة: لا تزعج الخرزات المرتبطة بالمغناطيس. يوصى باستخدام ماصة النقل.</li>
	<li>أخرج الأنبوب B من حامل المغناطيس وتخلص منه.</li>
	<li>ضع الأنبوب C على الفور في حامل المغناطيس واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>ماصة بعناية تعليق الخلية المخصب في أنبوب الطرد المركزي المسمى وأعلى ما يصل إلى 2 مل مع PBS.</li>
	<li>انقل 50 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كوب عينة من عداد الخلية الآلي. للحصول على عدد خلايا تخفيف 1:10 ، أضف 450 ميكرولتر من PBS. انتقل إلى القسم 5 لمعرفة خطوات عد الخلايا.</li>
</ol>4. تنقية PBMC - الطريقة الآلية
ملاحظة: يمكن معالجة ما يصل إلى 4 عينات بواسطة أداة PBMC آلية واحدة. يمكن تشغيل أدوات متعددة بالتوازي بواسطة مشغل واحد.
<ol><li>تسمية 2 × 14 مل أنابيب مع الحرفين A و B ، 1 × 50 مل أنبوب الطرد المركزي مع الحرف C ، و 1 × 50 مل أنبوب الطرد المركزي مع "النفايات". ملاحظة: مطلوب حاوية نفايات واحدة فقط لكل تشغيل على أداة PBMC الآلية. استخدم الترقيم التسلسلي في حالة إجراء أكثر من عينة واحدة ، أي 1A و 1B و 1C و 2A و 2B و 2C.</li>
	<li>أضف 60 ميكرولتر من 0.1 M EDTA (لتركيز EDTA النهائي 6 mM) إلى الأنبوب A الذي يحتوي على طبقة buffy المنقولة في الخطوة 2.3.</li>
	<li>دوامة أنبوب الخرزة المغناطيسية (انظر جدول المواد)  لمدة 30 ثانية.</li>
	<li>قم بتشغيل أداة PBMC الآلية عن طريق تشغيل الطاقة في مقدمة الجهاز.</li>
	<li>على الشاشة الرئيسية لأداة PBMC الآلية ، حدد ملف التعريف وحدد البروتوكول المطلوب. ملاحظة: EasySep عزل PBMC البشري المباشر 19654 - كان Buffy Coat هو ملف تعريف البروتوكول المحدد لعزل PBMC هذا. راجع الإجراء القياسي للمصنع لهذا الملف الشخصي في تقرير البروتوكول14.</li>
	<li>أدخل حجم البداية (كمية معطف بافي المستنشق في الأنبوب A) ، وكرر لكل عينة.</li>
	<li>حدد جميع الأرباع التي ستستخدم نفس مجموعة الكاشف. ملاحظة: إذا تم استخدام نفس البروتوكول لأكثر من ربع واحد ، فسيقترح جهاز PBMC الآلي استخدام نفس مجموعة الكاشف لجميع الأرباع14.</li>
	<li>قم بتحميل دائري الجهاز بالمواد الاستهلاكية المصنفة وأطراف التصفية والحاوية العازلة. يجب تحميل مجموعة الكاشف التي تحتوي على أنبوب الخرزة المغناطيسية وأنبوب مزيج الكوكتيل في الربع 1. ملاحظة: ستسأل الأداة عما إذا كان المستخدم يرغب في استخدام مجموعة كاشف 1 لجميع الأرباع. حدد "نعم" وقم بتمييز جميع الأرباع باستخدام مجموعة الكاشف.</li>
	<li>بمجرد اكتمال التحميل ، قم بإزالة الأغطية من المواد الاستهلاكية والكواشف وحدد تشغيل على شاشة الجهاز.</li>
	<li>عند اكتمال التشغيل ، حدد تفريغ وإزالة العينات (التي تحتوي على تعليق PBMC المسمى في الأنبوب C) من دائري الجهاز. قم بتخزين أنبوب الخرزة المغناطيسية وأنبوب مزيج الكوكتيل والحاوية العازلة عند 4 درجات مئوية. تجاهل الأنابيب المصنفة على أنها A و B والنفايات (انظر الخطوة 4.1) ونصائح التصفية. ملاحظة: لا يلزم زيادة رصيد PBS للطريقة الآلية ، حيث ينتج تعليق PBMC حجما نهائيا يبلغ 7 مل.</li>
	<li>انقل 500 ميكرولتر من الخلايا إلى كوب عينة لعدد الخلايا بدون تخفيف. انتقل إلى القسم 5 لحساب الخلايا.</li>
</ol>5. عد الخلايا
<ol><li>قم بإجراء عد الخلايا وصلاحيتها باستخدام طريقة استبعاد صبغة التريبان الزرقاء باتباع تعليمات الشركة المصنعة15. ملاحظة: بالنسبة للعمليات الداخلية للمؤلف ، يتم إجراء تحليل الخلية باستخدام عداد خلية آلي مع الإعدادات التالية للحصول على PBMCs. عامل التخفيف = 10 (للبروتوكول اليدوي ، إذا كان تعليق الخلية بحجم منخفض) أو 1 (للبروتوكول الآلي) نوع الخلية: PBMC نطاق التركيز = 5 × 104 إلى 1 × 107 خلايا / مل نطاق الحجم (القطر) = 8 ميكرومتر إلى 50 ميكرومتر عدد الصور = 50</li>
</ol>6. إعداد الحفظ بالتبريد
<ol><li>أجهزة الطرد المركزي (باستخدام دوار دلو متأرجح) أنابيب العينة عند 300 × جم لمدة 8 دقائق عند 22 درجة مئوية مع تشغيل الفرامل (9 تسارع / 9 تباطؤ).</li>
	<li>بعد الطرد المركزي ، ضع العينات مرة أخرى في خزانة السلامة البيولوجية.</li>
	<li>باستخدام ماصة ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية. يمكن ترك كمية صغيرة من المادة الطافية مع حبيبات PBMC لضمان عدم إزعاجها.</li>
	<li>أعد تعليق الحبيبات في 3 مل من وسط الحفظ بالتبريد البارد. امزج التعليق ببطء ورفق لأعلى ولأسفل حتى يصبح متجانسا. ملاحظة: يمكن تعديل حجم وسط الحفظ الخلوي بناء على تركيز PBMC النهائي المطلوب.</li>
	<li>قم بتوزيع 1 مل من PBMC المعاد تعليقه في أنبوب تبريد مخصص مسبقا وضعه داخل حاوية تجميد معدل التحكم لمدة لا تقل عن 4 ساعات عند -80 درجة مئوية. ملاحظة: يمكن تعديل حجم PBMCs المقتبسة لكل أنبوب تبريد بناء على تفضيل الباحث.</li>
	<li>بعد تخزين أنابيب التبريد عند -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات ، انقل أنابيب التبريد إلى خزان طور بخار النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.</li>
</ol>7. تحليل البيانات الإحصائية
<ol><li>تم تحليل بيانات النتائج التمثيلية باستخدام البرامج الإحصائية والرسوم البيانية كما هو محدد في الملف التكميلي 3.</li>
</ol>

عزل PBMC عالي الإنتاجية باستخدام حبات مغناطيسية مناعية

<ol>
	<li>Alexovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+mononuclear+cells:+A+review+of+recent+proteomic+applications.">Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications.</a> Proteomics. 22 (15-16), e2200026 (2022).</li><li>Zhang, M., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multi-differentiation+potential+of+peripheral+blood+mononuclear+cells.">The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48 (2012).</li><li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research.">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).</li><li>Kleeberger, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+and+recovery+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+cryopreserved+for+up+to+12+years+in+a+multicenter+study.">Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).</li><li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+(PBMC)+by+density+gradient+centrifugation+on+percoll.">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li><li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).</li><li>Gautam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+gene+expression+profiles+of+whole+blood+and+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+multiple+collection+and+processing+methods.">Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods.</a> PLoS One. 14 (12), e0225137 (2019).</li><li>Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+validation+for+automated+isolation+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells.</a> Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).</li><li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+biobanking+using+a+robotized+liquid+handling+workstation.">Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation.</a> J Transl Med. 17 (1), 371 (2019).</li><li>Stemcell Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 27156, (2020).</li><li>Hornschuh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+magnetic+sorting+preserves+the+functionality+of+ex+vivo+cultivated+non-adherent+human+monocytes.">Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes.</a> Biology (Basel). 11 (11), 1583 (2022).</li><li>Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+isolated+by+positive+and+negative+magnetic+sorting+techniques+show+different+molecular+characteristics+and+immunophenotypic+behaviour.">Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour.</a> F1000Res. 6, 2045 (2017).</li><li>Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+processing+for+pathogen+inactivation+of+double-dose+buffy-coat+platelet+concentrates:+Maintained+in+vitro+quality+over+7-day+storage.">Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage.</a> Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).</li><li>Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. Available from: <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html">https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html</a> (2022)</li><li>. Vi-cell XR cell viability analyzer instructions for use Available from: <a target="_blank" href="https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf">https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf</a> (2017)</li><li>Fuchs, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+biobanking:+Employing+a+robotic+system+for+automated+mononuclear+cell+isolation.">Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation.</a> Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).</li><li>Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology, white blood cell. , (2024).</li><li>Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+buffy+coat+extract+on:+Methodology,+feasibility,+optimization,+and+validation+study.">Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study.</a> Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).</li><li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield,+but+severly+compromise+cell+viability.">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li><li>Yi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+delayed+PBMC+processing+on+functional+and+genomic+assays.">Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays.</a> J Immunol Methods. 519, 113514 (2023).</li><li>Mckenna, K. C., Beatty, K. M., Vicetti Miguel, R., Bilonick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+processing+of+blood+increases+the+frequency+of+activated+CD11b++CD15++granulocytes+which+inhibit+t-cell+function.">Delayed processing of blood increases the frequency of activated CD11b+ CD15+ granulocytes which inhibit t-cell function.</a> J Immunol Methods. 341 (1-2), 68-75 (2009).</li><li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+t-cell+responses:+Position+statement+of+the+t-cell+workshop+committee+of+the+immunology+of+diabetes+society.">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive t-cell responses: Position statement of the t-cell workshop committee of the immunology of diabetes society.</a> Clin Exp Immunol. 163 (1), 33-49 (2011).</li><li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+(PBMC)+functional+applications.">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

PBMCs البشرية هي أنواع خلايا متعددة الاستخدامات تستخدم في العديد من المقايسات. ومع ذلك ، غالبا ما يكون معدل إنتاجية العزل قيدا في العديد من المختبرات ، بما في ذلك Biobanks16. في السابق ، قام البنك الحيوي على مستوى الولاية الصحية في نيو ساوث ويلز بعزل PBMCs باستخدام طريقة تدرج الكثافة. تم التحقيق في الأتمتة لطريقة فصل تدرج الكثافة لزيادة قدرة المعالجة ، ولكن تم تحديد العوائق التي تحول دون التنفيذ ، بما في ذلك (i) تكلفة معالج السوائل مع وحدة الطرد المركزي لتكون مؤتمتة بالكامل ، مع المتطلبات الإضافية لوحدة HEPA لإنتاج منتج معقم ، (ii) موظفين مدربين على البرمجة ، و (iii) الوقت اللازم لاختبار البروتوكول. لذلك ، استكشفت هذه الدراسة طرقا بديلة وحددت مجموعة PBMC البشرية التي تم الحصول عليها تجاريا والتي يمكن استخدامها للمعالجة اليدوية والآلية. يتم ضمان العقم لأن المعدات المطلوبة للمعالجة تتناسب مع خزانة السلامة البيولوجية القياسية (بطول 1.2 متر). تفصل هذه الورقة التعديلات التي تم إجراؤها على البروتوكول14 الموصى به من قبل الشركة المصنعة ، لزيادة الكفاءة وخفض تكاليف الكاشف دون التضحية بالجودة. بالإضافة إلى ذلك ، تم توسيع بروتوكول الشركة المصنعة لتفصيل خطوات عينات البنك الحيوي للبحث المستقبلي ، بما في ذلك الدم الكامل (الخطوة 1.2) ، والبلازما (الخطوة 2.2) ، و RBC (الخطوة 2.5) من أنبوب الدم الأصلي ، وكذلك عد الخلايا والحفظ بالتبريد.
في هذه الدراسة ، تمت مقارنة ثلاثة بروتوكولات عزل PBMC: فصل تدرج الكثافة ، والعزل اليدوي ، والآلي القائم على الخرز. تم إجراء تعديلات على بروتوكول الشركة المصنعة اليدوي القائم على الخرز ، بما في ذلك إزالة تخفيف معطف بافي قبل عزل PBMC ، وإلغاء متطلبات انقطاع التيار الكهربائي لأجهزة الطرد المركزي ، مما يسمح للمحققين باتباع بروتوكول عزل PBMC قابل للتكيف وفعال من حيث التكلفة وعالي الإنتاجية. أولا ، تم استخدام ثماني عينات دم كاملة متطابقة لعزل PBMCs لمقارنة فصل تدرج الكثافة والتقنية اليدوية القائمة على الخرز. الأهم من ذلك ، أن توزيعات مجموعات الخلايا ، وصلاحية الخلية ، واستعادة PBMCs لم تكن مختلفة بشكل كبير بين الطريقتين المقارنتين ، كما هو موضح في الشكل 2A-F ، والشكل 3A ، والشكل التكميلي 1 ، على التوالي. في البيانات التمثيلية ، كان عدد الخلايا أعلى لطريقة فصل تدرج الكثافة باستخدام طريقة استبعاد تريبان الأزرق ولكن ليس عند استخدام محلل خلايا أمراض الدم. استخدمت إعدادات نوع خلية PBMC على عداد الخلية نطاق قطر الخلية من 8-50 ميكرومتر ، وبالتالي ، ستشمل الأعداد PBMCs وكذلك الخلايا المحببة (قطرها حوالي 12-15 ميكرومتر) عند استخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق17. في حين أن عداد الخلايا الدموية قدم خصوصية أعلى من طريقة استبعاد التريبان الأزرق ، كانت بعض حسابات الاسترداد أعلى من 100٪ ، مما يعكس هامش الخطأ في الأداة (انظر الشكل التكميلي 1). لذلك ، يوصى بأن يطبق الباحثون مجموعة من تقنيات عد الخلايا عند مقارنة العوائد من بروتوكولات عزل PBMC ، لأن معظم التقنيات لا تقدم كلا من تعداد الخلايا التفاضلية المحددة والحساسة للغاية. علاوة على ذلك ، لم يتم إجراء المقايسات لمقارنة النشاط الوظيفي ل PBMCs الناتجة عن أي من التقنيتين ، وهو قيد على تحليلنا.
بعد ذلك ، تمت مقارنة الطرق اليدوية والآلية القائمة على الخرز ، ولم يتم تحديد فروق ذات دلالة إحصائية بين إنتاجية PBMC أو صلاحيتها من 8 عينات متطابقة (الشكل 4 أ ، ب). لم تتم مقارنة مجموعات الخلايا بشكل فردي ، حيث تم استخدام نفس كوكتيل عزل الأجسام المضادة لكلتا الطريقتين. الأهم من ذلك ، تم تقليل الوقت العملي لمعالجة 8 عينات من 43 دقيقة إلى 22 دقيقة باستخدام البروتوكول الآلي (الشكل 4C). في حين يتم ضمان الإنتاجية ، والوقاية من إرهاق الفني ، واتساق معالجة العينات باستخدام الأتمتة ، فإن تكلفة الكواشف والمواد الاستهلاكية أعلى بكثير عند 3-4 أضعاف أكثر من الطريقة اليدوية القائمة على الخرز. هذا بعد إجراء تعديلات على بروتوكول التصنيع لاستخدام 1 مل من معطف بافي (من حجم دم كامل يبلغ 10 مل) بدلا من النطاق الموصى به من 2-5 مل (من حجم دم كامل يبلغ 10 مل و / أو أكثر). إذا كانت الميزانية قيدا ، فإن اختيار الطريقة اليدوية يمكن أن يقلل من وقت المعالجة بنسبة ~ 25٪ مع الحفاظ على تكاليف الكاشف والتكاليف الاستهلاكية المماثلة لتلك الخاصة بطريقة فصل الكثافة. يوصى بمعالجة ما لا يزيد عن 8 عينات في المرة الواحدة لكل فني لضمان تداخل العينات بشكل كاف (~ 30 ثانية / عينة) خلال فترات الحضانة البالغة 5 دقائق (الخطوات 3.7 و 3.11 و 3.14).
في كل من الطرق اليدوية والآلية القائمة على الخرز ، تعد إزالة معطف بافي خطوة حاسمة لضمان عزل PBMC الأمثل. من المهم ملاحظة أنه يتم استخدام معطف بافي بدلا من الدم الكامل في هذا البروتوكول حيث يعتمد حجم الكواشف على أحجام المواد الأولية10. يمكن أن تكون إزالة حجم معطف بافي بالكامل بشكل فعال تحديا تقنيا. في البداية ، قامت هذه الطريقة بإزالة 0.5 مل من معطف بافي ، ولكن تم زيادته إلى 1 مل لتحسين التعافي. لضمان التعافي الكافي والمتسق لمعطف بافي ، فإن تفصيل هذه العملية مهم في توثيق البروتوكول والتدريب. يوصى بتدوير طرف ماصة أثناء شفط معطف بافي مع الحرص على عدم استنشاق الكثير من كرات الدم الحمراء من الطبقة أدناه (الخطوة 2.3). من المهم عدم تشبع كوكتيل الأجسام المضادة الذي يربط الخلايا غير المرغوب فيها (أي الخلايا المحببة وخلايا الدم الحمراء) ، والتي يمكن أن تؤثر على المحصول والنقاء10. لتقليل كرات الدم الحمراء التي تم جمعها أثناء استخراج معطف بافي ، يجب أن يكون طرف الماصة بين طبقة معطف البلازما وطبقة معطف بافي. يمكن زيادة حجم معطف بافي من 1 مل ؛ ومع ذلك ، يجب توخي الحذر كما هو موضح أعلاه للتأكد من أن ما لا يزيد عن 10٪ من الحجم الذي تم جمعه يحتوي على كرات الدم الحمراء. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام معالج سائل آلي لجمع معاطف بافي باستمرار18. ومع ذلك ، فإن الساعات المخصصة المطلوبة لمعايرة بروتوكولات أدوات مناولة السوائل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، خاصة بالنظر إلى النفقات ، قد لا تكون مجدية لمعظم المختبرات.
كان انتقال وتطبيق البروتوكول القائم على حبة الأتمتة أمرا ضروريا نظرا لهدف البنك الحيوي على مستوى الولاية في نيو ساوث ويلز لمعالجة 23000 PBMCs على مدار سنوات 3 القادمة. هنا ، تم إثبات أنه يمكن عزل PBMCs من أنابيب ACD حتى 9 أيام من التجميع بمتوسط جدوى >70٪. في حين أن الغلة كانت مثالية بعد 24 ساعة من التجميع ، فإن المعالجة ضمن هذا الإطار الزمني ليست ممكنة دائما حيث قد يلزم نقل العينات. وقد تبين أن PBMCs المعزولة إما بالطريقة اليدوية أو الآلية القائمة على الخرز قد يكون لها غلة >3 × 105 خلايا / مل دم كامل عند عزلها في غضون 4 أيام من الجمع و >1 × 105 خلايا / مل دم كامل عند عزلها في غضون 10 أيام من جمعها. ويلاحظ انخفاض أعداد العينات التي تزيد عن 5 أيام كقيد على هذا التحليل. علاوة على ذلك ، لم يتم فصل البيانات بناء على أعمار المشاركين وجنسهم والتاريخ السريري ، حيث لم يتم توفير هذه المعلومات. على الرغم من الحاجة إلى تحليل مقارن لفحص آثار التأخير في أوقات المعالجة لكلتا الطريقتين ، فقد تم الإبلاغ سابقا عن أن التأخير في عزل PBMC باستخدام طريقة تدرج الكثافة يقلل من جودة الخلية ويزيد بشكل كبير من تلوث كرات الدم الحمراء 19,20. بالإضافة إلى ذلك ، تزداد نسب المحببات إذا تأخرت المعالجة ، وبالتالي ، يجب تجميع العينات ذات "الأعمار" المتشابهة للتحليلات النهائية20،21،22. وتجدر الإشارة إلى أن هذه التجربة أجريت باستخدام مضادات تخثر الدم مع سكر العنب الحمضي (أي سترات الصوديوم وحامض الستريك وسكر العنب). ومع ذلك ، قد يختلف العائد و / أو نسبة أنواع الخلايا إذا تم استخدام مضادات التخثر الأخرى23 ؛ لذلك ينصح الباحثون باختيار مضاد تخثر مناسب بناء على تحليلات PBMC المقصودة.
باختصار ، تم تفصيل بروتوكول لعزل PBMC باستخدام حبات مغناطيسية قابلة للتكيف مع سير العمل عالي الإنتاجية لتلبية متطلبات القياس دون المساس بصلاحية الخلية. يمكن تحسين كل من الطرق اليدوية والآلية لإنتاج تركيزات معينة للخلايا عن طريق تغيير أحجام البدء وإعادة التعليق. انتقل البنك الحيوي على مستوى ولاية نيو ساوث ويلز للصحة من استخراج ~ 60 PBMCs شهريا باستخدام تقنية فصل تدرج الكثافة التقليدية إلى ~ 300 PBMCs شهريا باستخدام هذه الطريقة القائمة على الخرز المتوافقة مع الأتمتة. الهدف التالي للمؤلفين هو استخدام المنصة الآلية لمعالجة ما يصل إلى 1200 PBMCs شهريا ومقارنة PBMCs المعزولة بواسطة كل من تقنيات الحبيبات المغناطيسية (اليدوية والآلية) وتدرج الكثافة لتوجيه تنفيذ هذه التقنية إلى مختبرات أخرى مع التركيز بشكل خاص على البنوك الحيوية.

عزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMC) هي تقنية تفصل وتعزل الخلايا الليمفاوية والوحيدات عن مكونات الدم الكاملة الأخرى. PBMCs هي نوع من الخلايا متعددة الاستخدامات تستخدم في العديد من التطبيقات بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، العلاج المناعي ، وتطوير اللقاح ، وتحديد الهدف أو العلامات الحيوية ، وتطوير الأدوية ذات الأجسام المضادة / الجزيئاتالصغيرة 1,2. يمكن عزل هذه الخلايا عن الأفراد الأصحاء أو المرضى ويمكن استخدامها على الفور في عمليات المصب أو حفظها بالتبريد للبحث المستقبلي3. في بعض الحالات ، يكون الغرض النهائي معروفا ، بينما في حالات أخرى ، كما هو شائع في البنوك الحيوية ، يتم عزل PBMCs وتخزينها لتطبيقات مستقبلية غير محددة4.
الطرد المركزي المتدرج الكثافة هو التقنية التقليدية لعزل PBMCs5،6،7 من الدم الكامل ، باستخدام الفصل التفاضلي لأنواع الخلايا المكونة بناء على كثافة الخلية أثناء الطرد المركزي. في حين أنه قد يكون هناك بعض الاختلاف في هذه الطريقة ، يتم تخفيف الدم الكامل بشكل عام باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ويتم وضعه فوق وسط تدرج الكثافة في أنبوب طرد مركزي متخصص أو قياسي ، ثم يتم غزله. ينتج عن ذلك أربع طبقات متميزة: طبقة البلازما العلوية غنية بالصفائح الدموية ، وطبقة PBMC رقيقة فوق وسط تدرج الكثافة ، وأخيرا ، تتكون الطبقة السفلية من خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) والخلايا المحببة. على الرغم من أن هذه الطريقة قد أطلق عليها سابقا اسم "المعيار الذهبي"8 ، إلا أن هناك قيودا على التوسع ، مثل وقت المعالجة الطويل ، وقدرة أجهزة الطرد المركزي ، وصعوبة اقتباس منتجات الدم الأخرى (مثل البلازما وكرات الدم الحمراء) ، وكونها شاقة للأتمتة. في حين أن الأتمتة ممكنة لهذه الطريقة9 ، إلا أنها تتطلب برمجة شاملة لمعالج سائل (مع وحدة طرد مركزي لتكون مؤتمتة بالكامل) وستظل عملية طويلة.
من الآن فصاعدا ، يتم تقديم سير عمل بديل يستخدم فصل الخرزة المغناطيسية المناعية إما بمغناطيس ثمانية حاملات للمعالجة اليدوية أو أداة للمعالجة المؤتمتة بالكامل. تستخدم هذه الطريقة كوكتيل الأجسام المضادة الذي يضاف إلى الخلايا ويربط مجموعات الخلايا غير المرغوب فيها ، في هذه الحالة ، الصفائح الدموية والخلايا المحببة وكرات الدم الحمراء. تتم إزالة هذه المجموعات غير المرغوب فيها لاحقا عن طريق الفصل المغناطيسي ، تاركة مجموعات الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية في الجزء السالب الجاهز للمعالجةالنهائية 10. طريقة الانتقاء السلبي هذه أسرع من طرق الانتقاء الإيجابي التي تتطلب خطوات إضافية لإزالة الجسم المضاد ومركب الخرزة المغناطيسية من PBMCs. يعد الاختيار السلبي مفيدا أيضا حيث تم وصفه بأنه طريقة للحفاظ على وظائف الخلية11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell cryopreservation media CS10, 100 mL (CRYOSTOR)</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>51033311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell 1 mL FX</td>
			<td>BioTools</td>
			<td>BCS-407P</td>
			<td>This is the control rate freezing container used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water&#160;</td>
			<td>Bacto Laboratories</td>
			<td>561832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DxH 500 Hematology Analyzer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B40601</td>
			<td>Referred to as external automated cell counter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyEightsTM EasySepTM Magnet</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>18103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>19654</td>
			<td>Kit includes the magnetic bead tube and the cocktail mix tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td>Instructions to make 0.1M EDTA solution from EDTA salt is located in supplemental file 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LymphoprepTM Density Gradient Medium</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>7851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge ST4 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>THR75009903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orion Star A211 pH meter electrode</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orion&#8482; ROSS Ultra&#8482; Glass Triode&#8482; pH/ATC Combination Electrodes</td>
			<td>Thermo ScientififcTM</td>
			<td>8302BNURCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), solution, 1X, 500ml</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSepTM Buffer 1X</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>20104</td>
			<td>Software used for statistical analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSepTM-S</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>21000</td>
			<td>Fully automated cell separator instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep&#8482; Filter Tips</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>20125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SepMateTM-50 (IVD) tubes</td>
			<td>StemCellTM Technologies</td>
			<td>85460</td>
			<td>IVD - In vitro diagnostics. Also known as SepMateTM-50 tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR Cell Anlayzer</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Internal automated cell counter. Instrument obsolete and no longer available for purchase (as of December 31, 2022). Alternative instrument is the ViCell BLU Cell Viability Analyzer (Product no. C19196).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL XR Quad Pack Reagent Kit</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>383722</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating human peripheral blood mononuclear cells from buffy coats via high throughput immunomagnetic bead separation

خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية. تتمتع PBMCs المحفوظة بالتبريد بصلاحية مستقرة في التخزين طويل الأجل ، مما يجعلها نوعا مثاليا من الخلايا للعديد من أغراض البحث النهائية ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي والمقايسات المناعية وتسلسل الجينوم. عادة ، يتم عزل PBMCs عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة ، ومع ذلك ، فهو سير عمل منخفض الإنتاجية يصعب ومكلف توسيع نطاقه. تقدم هذه المقالة سير عمل عالي الإنتاجية باستخدام طريقة عزل PBMC المستندة إلى حبة مغناطيسية سريعة التنفيذ. تمت مقارنة التركيز الكلي للخلايا وصلاحيتها وتوزيعها مع PBMCs التي تم الحصول عليها باستخدام عزل تدرج الكثافة ، وكانت صلاحية الخلية ونسبة أنواع الخلايا قابلة للمقارنة لكلتا التقنيتين. أظهرت PBMCs المعزولة أكثر من 70٪ من الصلاحية حتى 9 أيام بعد جمع الدم ، على الرغم من انخفاض المحصول بمقدار النصف بعد 5 أيام مقارنة ب PBMCs التي تمت معالجتها في غضون 24 ساعة من جمعها. باختصار، توضح هذه المقالة بروتوكول PBMC الذي يستخدم نهجا قائما على الخرزة للتكيف مع سير عمل عالي الإنتاجية ويوضح أن كلا من الأساليب اليدوية والآلية المستندة إلى الخرز يمكن أن تزيد من قدرة المعالجة وتوفر المرونة للميزانيات المختلفة.

Peripheral blood mononuclear cell (PBMC) isolation is a technique that separates and isolates lymphocytes and monocytes from other whole blood constituents. PBMCs are a versatile cell type used for numerous applications including, but not limited to, immunotherapy, vaccine development, target or biomarker identification, and antibody/small molecule drug development1,2. These cells may be isolated from healthy or diseased individuals and can be used immediately in downstream processes or cryopreserved for future research3. In some instances, the downstream purpose is known, while in others, as is common in biobanking, PBMCs are isolated and stored for future unspecified applications4.
Density gradient centrifugation is the traditional technique for isolating PBMCs5,6,7 from whole blood, utilizing the differential separation of the constituent cell types based on cell density during centrifugation. While there may be some variation in this method, whole blood is generally diluted with phosphate-buffered saline (PBS), layered over a density gradient medium in a specialized or standard centrifuge tube, and then spun. Four distinct layers result: the top plasma layer is enriched with platelets, a thin PBMC layer is above the density gradient medium, and finally, the bottom layer consists of red blood cells (RBCs) and granulocytes. Although this method has previously been termed &#39;the gold standard&#39;8, there are limitations for scale-up, such as lengthy processing time, centrifuge capacity, difficulty in aliquoting other blood products (i.e., plasma and RBCs), and being laborious to automate. While automation is possible for this method9, it does require comprehensive programming of a liquid handler (with a centrifugation module to be fully automated) and would remain a lengthy process.
Henceforth, an alternate workflow that uses immunomagnetic bead separation with either an eight-holder magnet for manual processing or an instrument for fully automated processing is presented. This method utilizes an antibody cocktail that is added to cells and binds unwanted cell populations, in this case, platelets, granulocytes, and RBCs. These unwanted populations are subsequently removed by magnetic separation, leaving monocyte and lymphocyte populations in the negative fraction that are ready for downstream processing10. This negative selection method is faster than positive selection methods which require additional steps to remove the antibody and magnetic bead complex from the PBMCs. Negative selection is additionally advantageous as it has been described as a way to preserve cell functionality11,12.

تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في عزل PBMC - تعزيز الإنتاجية والاتساق في البحث

عزل خلايا الدم البشرية الطرفية أحادية النواة من معاطف بافي عبر فصل حبة مغناطيسية مناعية عالية الإنتاجية

Isolating peripheral blood mononuclear cells, also known as PBMCs, is typically a lengthy and manual process. We saw an alternative method that'd be quick to implement and capable of processing high numbers of samples. Our protocol offers an automated high throughput method, ensuring consistency while preventing technician burnout.We also detail our medium throughput automation-compatible method that can be utilized during equipment downtime. This medium throughput option is a more budget-friendly alternative for other laboratories. A biobank can now process more samples with the same number of technicians.This will increase the specimen collection size as well as its diversity, enabling future research and improving patient care.

تم قياس نسب الخلايا الليمفاوية ، وحيدات ، العدلات ، الحمضات ، والخلايا القاعدية قبل (أي في الدم الكامل) وبعد عزل PBMC عندما تم عزل PBMCs باستخدام طريقة فصل التدرج القائم على الخرز أو الكثافة. تم إثراء نسب الخلايا الليمفاوية والوحيدات بشكل كبير بكلتا الطريقتين (الشكل 2 أ ، ب). بالإضافة إلى ذلك ، انخفضت نسب العدلات والحمضات والخلايا القاعدية (أي الخلايا المحببة) بشكل ملحوظ في PBMCs المعزولة بالطريقة القائمة على الخرز (الشكل 2C-F). لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في نسب الخلايا الليمفاوية ، وحيدات الخلايا ، العدلات ، الحمضات ، الخلايا القاعدية ، والخلايا المحببة بين تدرج الكثافة والطرق القائمة على الخرز (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، تم حساب النسبة المئوية للاسترداد لأنواع الخلايا المذكورة أعلاه (انظر الشكل التكميلي 1). كان متوسط صلاحية الخلية أكثر من 95٪ لكلتا الطريقتين ، ولم تكن مختلفة بشكل كبير (الشكل 3 أ). تم حساب PBMCs أيضا باستخدام نطاق حجم (قطر) من 8 ميكرومتر إلى 50 ميكرومتر ، حيث أنتجت طريقة فصل تدرج الكثافة ما يقرب من ضعف إجمالي عدد الخلايا (الشكل 3 ب). 
بعد ذلك ، تمت مقارنة الطريقة الآلية القائمة على الخرز بالطريقة اليدوية. لم يتم تحديد فروق ذات دلالة إحصائية لصلاحية الخلية (الشكل 4 أ) أو إجمالي عدد الخلايا (الشكل 4 ب) باستخدام الطريقة اليدوية أو الآلية. تمت مقارنة وقت معالجة هذه العينات ال 8 ، بما في ذلك وقت عدم التدخل الذي لا يتطلب أي تدخل بشري. كان إجمالي وقت المعالجة ل 8 عينات 43 دقيقة مقابل. 57 دقيقة للدليل مقابل الطريقة الآلية. تضمنت الطريقة الآلية 35 دقيقة من معالجة عدم التدخل (الشكل 4C).
تم تجريب سير العمل القائم على الخرزة لعزل PBMC (مع تسعير الدم الكامل والبلازما) على مدار 9 أشهر ، حيث تم عزل 1410 عينة PBMC من دم بشري غير مفحوص باستخدام المنصة اليدوية لأول 820 مشاركا ثم باستخدام الطريقة الآلية للمشاركين ال 590 التاليين. تم إجراء المعالجة إما في نفس اليوم أو حتى 10 أيام بعد التجميع وفقا لمعايير قبول الدراسة ، مع تأخير في المعالجة يرجع إلى حد كبير إلى أوقات عبور العينة. باستخدام الطريقة اليدوية أو الآلية ، كانت PBMCs التي تمت معالجتها في غضون 24 ساعة من المجموعة تتمتع بأعلى قابلية للتطبيق والاسترداد (الشكل 5). كان متوسط صلاحية الخلية >90٪ ل PBMCs التي تمت معالجتها في غضون 5 أيام و >70٪ ل PBMCs التي تمت معالجتها في غضون 10 أيام (الشكل 5 أ). انخفض متوسط غلة PBMC بنسبة 50٪ بعد 5 أيام مقارنة بالعينات المعالجة في غضون 24 ساعة (الشكل 5 ب).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig01.jpg"> الشكل 1: سير العمل التخطيطي لبروتوكول عزل PBMC القائم على الخرزة من معطف بافي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig02.jpg"> الشكل 2: نسب الخلايا الليمفاوية ، وحيدات ، العدلات ، الحمضات ، الخلايا القاعدية ، والخلايا المحببة في الدم الكامل قبل وبعد عزل PBMC بتدرج الكثافة والطرق القائمة على الخرز. النسبة المئوية للخلايا الليمفاوية (A) ، وحيدات (B) ، العدلات (C) ، الحمضات (D) ، الخلايا القاعدية (E) ، والخلايا المحببة (F) في الدم الكامل المطابق قبل عزل PBMC (المربعات) وفي PBMCs بعد العزل عبر تدرج الكثافة (الدوائر المفتوحة) أو طريقة القائمة على الخرز (الدوائر المغلقة) (n = 8). ns = غير معنوي ، و * p < 0.05 كما هو محدد بواسطة أحادي الاتجاه ANOVA (A و B) أو اختبار فريدمان (C- و). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig03.jpg"> الشكل 3: الصلاحية وعدد الخلايا الكلي ل PBMC المعزولة بواسطة تدرج الكثافة والطرق القائمة على الخرز. (أ) متوسط صلاحية الخلية (± SD) للعينات المعالجة باستخدام تدرج الكثافة (المربعات ، الشريط الداكن) مقابل الطرق القائمة على الخرز (الدوائر ، الشريط المفتوح) ل 8 عينات مقترنة. ns = غير مهم عن طريق اختبار t المقترن. (ب) إجمالي عدد الخلايا للعينات المعالجة باستخدام تدرج الكثافة (المربعات ، الشريط الداكن) مقابل الطرق القائمة على الخرز (الدوائر ، الشريط المفتوح) ل 8 عينات مقترنة. * تم تحديد P < 0.05 باستخدام اختبار t المقترن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig04.jpg"> الشكل 4: مقارنة بين الطرق اليدوية والآلية القائمة على الخرز. (أ) متوسط صلاحية الخلية (± SD) للعينات المعالجة باستخدام يدوي (مربعات ، شريط داكن) مقابل الطرق الآلية (الدوائر ، الشريط المفتوح) القائمة على الخرز ل 8 عينات مقترنة. ns = غير مهم بواسطة اختبار مان ويتني. (ب) إجمالي عدد الخلايا للعينات المعالجة باستخدام يدوي (مربعات) مقابل الطرق الآلية (الدوائر) القائمة على الخرز ل 8 عينات مقترنة. ns = غير مهم عن طريق اختبار t المقترن. (ج) وقت المعالجة ل 8 عينات تمت معالجتها باستخدام يدوي مقابل الطرق الآلية ، بما في ذلك التدريب العملي (شريط الضوء) والفترات الزمنية لعدم التدخل (الشريط المظلم). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig05.jpg"> الشكل 5: صلاحية وإنتاجية PBMC المعزولة عن الطريقة القائمة على الخرز إما يدويا أو باستخدام الأتمتة وفقا للوقت بين جمع العينات وتخزين PBMC. (أ) متوسط صلاحية الخلية (± 95٪ CI) لعينات المشاركين التي تمت معالجتها باستخدام دليل (شريط داكن) مقابل الطرق الآلية (الشريط المفتوح) القائمة على الخرز. جدول يوضح بالتفصيل أعداد المشاركين. ns = غير مهم. غير متوفر = غير قابل للتطبيق. * p < 0.05 بواسطة اختبار المقارنة المتعددة ل Tukey. (ب) إجمالي عدد الخلايا لعينات المشاركين التي تمت معالجتها باستخدام دليل (شريط داكن) مقابل الطرق الآلية (الشريط المفتوح) القائمة على الخرز. جدول يوضح بالتفصيل أعداد المشاركين. ns = غير مهم. غير متوفر = غير قابل للتطبيق. * p < 0.05 بواسطة اختبار المقارنة المتعددة ل Tukey. لا توجد قيمة لليوم 10 الآلي نظرا لأن رقم النسخ المتماثل أقل من 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي 1: شكل استرداد النسبة المئوية للخلية التفاضلية باستخدام تدرج الكثافة والطرق القائمة على الخرز. تم حساب النسبة المئوية باستخدام عدد الخلايا المطلق قبل العزل في الدم الكامل وتعليق الخلايا بعد العزل باستخدام طريقة تدرج الكثافة (المربعات ، الشريط الداكن) والطريقة القائمة على الخرز (الدوائر ، الشريط المفتوح) (ن = 8). ns = غير مهم ، و * p < 0.05 كما هو محدد بواسطة اختبار t غير المقترن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 1: بروتوكول تدرج الكثافة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%201_editedv2.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 2: تحضير 0.1 M EDTA ، درجة الحموضة 8.0 في PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%202_editedv2.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 3: الإجراءات التفصيلية التي تم تنفيذها لتوليد البيانات التمثيلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%203_editedv2.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

يفصل هذا البروتوكول طريقة متوافقة مع الأتمتة عالية الإنتاجية لعزل خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية لأغراض البنوك الحيوية وأغراض أخرى.

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are a heterogeneous population of monocytes and lymphocytes. Cryopreserved PBMCs have stable viability in ...

isolating-human-peripheral-blood-mononuclear-cells-from-buffy-coats

Research

JoVE Journal

Biology

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells from Buffy Coats via High Throughput Immunomagnetic Bead Separation

1.4K Views.  New South Wales Health Pathology. عادة ما يكون عزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية ، والمعروفة أيضا باسم PBMCs ، عملية طويلة ويدوية. لقد رأينا طريقة بديلة سريعة التنفيذ وقادرة على معالجة أعداد كبيرة من العينات. يوفر بروتوكولنا طريقة إنتاجية عالية مؤتمتة ، مما يضمن الاتساق مع منع إرهاق الف...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في عزل PBMC - تعزيز الإنتاجية والاتساق في البحث

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are a heterogeneous population of monocytes and lymphocytes. Cryopreserved PBMCs have stable viability in long-term storage, making them an ideal cell type for many downstream research purposes, including flow cytometry, immunoassays, and genome sequencing. Typically, PBMCs are isolated via&#160;density gradient centrifugation, however, it is a low-throughput workflow that is difficult and costly to scale. This article presents a high-throughput workflow using a magnetic bead-based PBMC isolation method that is quick to implement. Total cell concentration, viability, and population distribution with PBMCs obtained using density gradient isolation were compared, and cell viability and proportion of cell types were comparable for both techniques. Isolated PBMCs demonstrated over 70% viability up to 9 days after blood collection, although yield decreased by half after 5 days compared to PBMCs processed within 24 h of collection. In summary, this article describes a PBMC protocol that utilizes a bead-based approach to adapt to a high throughput workflow and demonstrates that both manual and automated bead-based methods can increase processing capacity and provide flexibility for various budgets.

This protocol details a high-throughput automation-compatible method to isolate human peripheral blood mononuclear cells for biobanking and other purposes.

Whole Blood Purification and Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Isolation Using Manual Method

To begin, gently invert 10-milliliter whole blood tubes 10 times at room temperature. Using a swinging bucket rotor, centrifuge the tubes at 800 g for 10 minutes at 22 degrees Celsius with the brake on. Then place the samples in a biological safety cabinet and check for the three distinct layers.Label three five-milliliter polystyrene tubes with letters A, B, and C.Swirl and collect one milliliter of the buffy coat by aspiration and transfer to the tube labeled as A.Then add 60 microliters of 0.1 molar EDTA to tube A containing the buffy coat. Add 50 microliters of the cocktail mix to tube A.Pipette up and down at least three times to mix it and incubate for five minutes at room temperature. After that, add 890 microliters of PBS to tube A and mixed by pipetting at least three times.Next, vortex the magnetic bead tube for 30 seconds. Add 50 microliters of the magnetic beads to tube A and pipette at least three times to mix the beads thoroughly. Immediately place tube A into the magnet stand and incubate for five minutes at room temperature.Then carefully pipette the enriched cell suspension into tube B, collecting the clear fraction with no or minimal red blood cells for optimal PBMC recovery. After that, remove tube A from the magnet stand and dispose of it. Next, add 50 microliters of magnetic beads to cell suspension in tube B and pipette up and down at least three times.Immediately place tube B into the magnet stand and incubate for five minutes at room temperature. Carefully pipette the enriched cell suspension into tube C, collecting only the clear fraction. Remove tube B from the magnet stand and dispose of it.Then immediately place tube C into the magnet stand and incubate for five minutes at room temperature. Carefully pipette the enriched cell suspension into a labeled centrifuge tube and top up to two milliliters with PBS. Transfer 50 microliters of the cell suspension to a sample cup of the automated cell counter.Add 450 microliters of PBS for a 1 to 10 dilution cell count.

تنقية الدم الكامل وعزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) باستخدام الطريقة اليدوية

Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Purification Using a High Throughput Automated Bead-Based Method

To begin, label two 14-milliliter tubes as A and B, one 15-milliliter centrifuge tube as C, and one 15-milliliter centrifuge tube as waste. After centrifuging the whole blood, collect and add one milliliter of the prepared buffy coat to tube A.Add 60 microliters of 0.1 molar EDTA to tube A.Then vortex the magnetic bead tube for 30 seconds. To turn on the automated PBMC instrument, switch the power on at the front of the instrument.On the instrument's home screen, select profile and choose the desired protocol. Then enter the starting volume and repeat for each sample. Select all the quadrants that will use the same reagent kit.Next, load labeled consumables, filter tips, and buffer container into each quadrant of the instrument's carousel as directed on the automated PBMC instrument screen. Once loading is complete, remove lids from consumables and reagents and select run on the instrument screen. When the run is complete, select unload and remove samples from the instrument's carousel.Transfer 500 microliters of the cells to a sample cup for a no-dilution cell count. Comparing the automated bead-based method to the manual method, no significant differences were identified in cell viability or total cell counts. The manual method processed eight samples in 43 minutes while the automated method took 57 minutes, including 35 minutes of hands-off processing.Mean cell viability was greater than 90%for PBMCs processed within five days and greater than 75%for those processed within 10 days. Mean PBMC yields decreased by 50%after five days compared to specimens processed within 24 hours.