يصف هذا البروتوكول كيف أن الجمع بين عدوى فيروس نقص المناعة البشرية البيئية مع الفئران Tmem119-EGFP يوفر نظاما بيولوجيا قيما للتحقيق في التغيرات الدبقية الدقيقة والخزانات الفيروسية في نماذج القوارض للاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية. أدى العلاج المشترك المضاد للفيروسات القهقرية إلى تحسين نوعية حياة الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية بشكل كبير. لفهم كيفية تأثير فيروس نقص المناعة البشرية على الجهاز العصبي المركزي ، من الضروري وجود نموذج موثوق وممكن لفيروس نقص المناعة البشرية.
في السابق ، تم تطوير نظام بيولوجي جديد يستخدم فيروس نقص المناعة البشرية الخيمري ، EcoHIV في نموذج الفئران للتحقيق في ضعف الإدراك العصبي والخلل الوظيفي المشبكي. لا يزال هناك تحد كبير في توضيح التوزيع العصبي التشريحي ل EcoHIV ، ولا سيما تعبيره التفاضلي في أنواع مختلفة من الخلايا في الدماغ. في الدراسة الحالية ، تم تعديل EcoHIV مع وضع العلامات على مضان mScarlet وحقنها بشكل رجعي في الفئران Tmem119-EGFP لتحديد ما إذا كانت الخلايا الدبقية الصغيرة هي نوع الخلايا الرئيسي المسؤول عن التعبير الفيروسي وخزان فيروس نقص المناعة البشرية في الدماغ.
للبدء ، قم بنقل خلايا دماغ الفئران الجنينية المنفصلة إلى صفيحة 12 بئرا مطلية مسبقا ب poly-L-lysine مع إدخالات زجاجية تحتوي على مليلتر واحد من DMEM-F12 بالإضافة إلى 10٪ FBS. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، استبدل الوسط بوسط عصبي قاعدي مكمل ب B27 واستمر في زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أسابيع.
ثم أضف 60 ميكرولترا من EcoHIV-mScarlet إلى مزرعة خلايا الدماغ واحتضنها لمدة ستة أيام. بعد الحضانة ، قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد. قم بإجراء التلوين المناعي لخلايا الدماغ المصابة باستخدام أجسام مضادة أولية محددة وصورها على مجهر متحد البؤر تحت هدف 40x.
تم تحديد الخلايا الدبقية الصغيرة على أنها نوع الخلايا المصابة الرئيسية في مزارع خلايا دماغ الفئران ، كما يتضح من تحديد موقع mScarlet مع علامات CD11b / c و Iba1. للبدء ، افتح فروة رأس فأر بالغ مقطوع الرأس وانقل أنسجة المخ إلى طبق بتري آخر يحتوي على خمسة ملليلتر من HBSS المعقم. انزع السحايا وانقل القشرة الأمامية إلى ملليلترين من HBSS.
بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من 0.25٪ تريبسين EDTA إلى الخليط. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مع تحريك الأنبوب كل بضع دقائق. انقل الخلايا المنفصلة إلى قارورة بولي إل ليسين مطلية مسبقا بحجم 75 سنتيمترا مربعا تحتوي على 10 ملليلتر من وسط DMEM-F12 و 10٪ FBS.
زراعة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تصل إلى 90٪ التقاء. بعد ذلك ، هضم خلايا الدماغ بملليلترين من 0.25٪ تريبسين-EDTA. استزراع خلايا الدماغ المهضومة في طبق زجاجي قاع مقاس 35 ملم يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط النمو DMEM-F12 حتى تصل إلى 80٪ من التقاء.
ثم أضف ثمانية ميكرولترات من EcoHIV-mScarlet إلى الخلايا الدبقية للفأر واحتضنها لمدة يومين. أصيبت الخلايا الدبقية الأولية للفأر البالغ بنجاح بفيروس نقص المناعة البشرية-mScarlet بعد يومين من العلاج. للبدء ، قم بتأمين الماوس المخدر Tmem119-EGFP في وضع جانبي.
قم بإذابة EcoHIV-mScarlet على الجليد. املأ المحلول الفيروسي في حقنة حاقن داخل العين بإبرة حادة عيار 33. ضع الماوس في الاستلقاء الجانبي الأيمن مع توجيه الرأس إلى اليسار.
تحديد منطقة الحقن حول منطقة العين. أدخل الإبرة ببطء وبلطف في القناة الإنسية للعين. ثم تقدم الإبرة إلى الأوعية خلف مقلة العين.
حقن 6.5 ميكرولتر من EcoHIV-mScarlet في الجيوب الأنفية المدارية الرجعية. بعد الحقن ، قم بإزالة الإبرة بعناية. ضع الفأر المخدر في وضع ضعيف داخل غطاء الدخان الكيميائي.
افتح الجلد على طول خط الوسط الصدري. ثم افصل الحجاب الحاجز وافتح الصدر بالمقص. الآن أدخل إبرة ونصف عيار 22 في البطين الأيسر.
افتح الأذين الأيمن بالمقص. قم ببث الأذين الأيمن ب 50 مل من 100 مللي مولار PBS المبرد مسبقا ، ثم قم بتقطيعه ب 100 مل من 4٪ بارافورمالدهيد المبرد مسبقا. قم بإزالة دماغ الفأر بالكامل.
بعد تثبيت الدماغ في 4٪ بارافورمالدهايد ، قم بتأمين أنسجة المخ باستخدام لاصق الأنسجة على المنصة المعدنية للاهتزاز. قطع أقسام إكليلية بسمك 50 ميكرومتر بشفرات من الصلب الكربوني. بعد ذلك ، ضع شرائح الدماغ على شرائح زجاجية باستخدام فرشاة.
أضف على الفور 0.1 مل من وسيط التثبيت المضاد للبهتان إلى كل قسم. ضع غطاء مقاس 22 × 50 ملم فوق أقسام الدماغ وجفف شرائح Superfrost في الظلام ليوم واحد. في اليوم التالي ، استخدم مجهرا متحد البؤر بأطوال موجية 488 نانومتر و 594 نانومتر للحصول على صور متعددة القنوات لمنطقة الدماغ التي تهمك.
لوحظت إشارات EcoHIV-mScarlet بشكل أساسي في الخلايا الدبقية الصغيرة المسماة ب EGFP في دماغ الفأر Tmem119-EGFP. لم يتم الكشف عن عدوى عصبية كبيرة في خلايا دماغ الفئران المستنبتة المعالجة ب EcoHIV-mScarlet.
