이 프로토콜은 EcoHIV 감염과 Tmem119-EGFP 마우스의 조합이 HIV 관련 신경인지 장애의 설치류 모델에서 미세아교세포 변형 및 바이러스 저장소를 조사하기 위한 귀중한 생물학적 시스템을 제공하는 방법을 설명합니다. 항레트로바이러스 병용 요법은 HIV에 감염된 사람들의 삶의 질을 극적으로 향상시켰습니다. HIV가 중추 신경계에 어떤 영향을 미치는지 이해하려면 신뢰할 수 있고 실현 가능한 HIV 모델이 필요합니다.
이전에는 신경인지 장애와 시냅스 기능 장애를 조사하기 위해 키메라 HIV인 EcoHIV를 사용하는 새로운 생물학적 시스템을 쥐 모델에서 개발했습니다. EcoHIV의 신경해부학적 분포, 특히 뇌의 다양한 세포 유형에서 차등 발현을 명확히 하는 데 중요한 과제가 남아 있습니다. 이번 연구에서는 mScarlet 형광 표지가 있는 EcoHIV를 변형하고 Tmem119-EGFP 넉인 마우스에 역궤도 주입하여 미세아교세포가 바이러스 발현을 담당하는 주요 세포 유형이자 뇌의 HIV 저장소인지 확인했습니다.
먼저 해리된 태아 쥐의 뇌 세포를 1밀리리터의 DMEM-F12와 10%FBS가 함유된 유리 인서트가 있는 폴리-L-라이신 사전 코팅된 12웰 플레이트로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 밤새 세포를 배양합니다. 다음날, 배지를 B27이 보충된 Neurobasal 배지로 교체하고 3주 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 세포를 계속 배양합니다.
그런 다음 60마이크로리터의 EcoHIV-mScarlet을 뇌 세포 배양에 추가하고 6일 동안 배양합니다. 배양 후 4%파라포름알데히드로 세포를 고정합니다. 특정 1차 항체를 사용하여 감염된 뇌 세포에 면역 염색을 수행하고 40x 대물렌즈 아래의 컨포칼 현미경에서 이미지화합니다.
미세아교세포는 쥐의 뇌세포 배양에서 주요 감염 세포 유형으로 확인되었으며, 이는 CD11b/c 및 Iba1 마커와 mScarlet의 공동 국소화에 의해 입증되었습니다. 먼저, 목이 잘린 성체 쥐의 두피를 열고 뇌 조직을 5밀리리터의 멸균된 HBSS가 들어 있는 다른 페트리 접시에 옮깁니다. 수막을 벗겨내고 전두엽 피질을 2ml의 HBSS로 옮깁니다.
다음으로, 20 마이크로 리터의 0.25 % 트립신 -EDTA를 혼합물에 첨가하십시오. 실온에서 15분 동안 배양하고 몇 분마다 튜브를 빙빙 돌립니다. 해리된 세포를 10밀리리터의 DMEM-F12 배지 및 10%FBS가 들어 있는 폴리-L-라이신이 사전 코팅된 75제곱센티미터 플라스크로 옮깁니다.
섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 90% 포화도에 도달할 때까지 세포를 배양합니다. 다음으로, 2mL의 0.25%트립신-EDTA로 뇌세포를 소화시킵니다. 소화된 뇌세포를 80% 농도에 도달할 때까지 5밀리리터의 DMEM-F12 성장 배지가 들어 있는 35mm 유리 바닥 접시에 계대배양합니다.
그런 다음 8마이크로리터의 EcoHIV-mScarlet을 마우스 신경교세포에 넣고 2일 동안 배양합니다. 성체 마우스의 일차 신경교세포는 치료 2일 후 EcoHIV-mScarlet에 성공적으로 감염되었습니다. 먼저 마취된 Tmem119-EGFP 마우스를 측면 위치에 고정합니다.
EcoHIV-mScarlet을 얼음 위에서 해동합니다. 바이러스 용액을 33게이지 뭉툭한 바늘로 안구 주사기에 채웁니다. 머리가 왼쪽을 향하도록 마우스를 오른쪽 측면 누운 자세에 놓습니다.
눈 주위 주사 부위를 확인합니다. 천천히 그리고 부드럽게 바늘을 눈의 내측 안각에 삽입합니다. 그런 다음 안구 뒤의 혈관으로 바늘을 밀어 넣습니다.
6.5마이크로리터의 EcoHIV-mScarlet을 후안와동에 주입합니다. 주사 후 바늘을 조심스럽게 제거하십시오. 마취된 마우스를 화학 흄 후드 안에 누운 자세로 놓습니다.
흉부 정중선을 따라 피부를 엽니다. 그런 다음 횡격막을 분리하고 가위로 가슴을 엽니다. 이제 22게이지 1/2 바늘을 좌심실에 삽입합니다.
가위로 오른쪽 아트리움을 엽니다. 50ml의 사전 냉각된 100millimolar PBS로 오른쪽 아트리움을 관류한 다음 100ml의 사전 냉각된 4% 파라포름알데히드로 관류합니다. 전체 마우스 뇌를 제거합니다.
4%파라포름알데히드로 뇌를 고정한 후 Vibratome의 금속 플랫폼에 조직 접착제를 사용하여 뇌 조직을 고정합니다. 탄소강 블레이드로 50마이크로미터 두께의 코로나 단면을 절단합니다. 다음으로, 브러시를 사용하여 뇌 조각을 유리 슬라이드에 놓습니다.
즉시 각 섹션에 0.1ml의 페이드 방지 장착 매체를 추가합니다. 뇌 부분에 22 x 50mm 커버 슬립을 놓고 Superfrost 슬라이드를 하루 동안 어둠 속에서 말리십시오. 다음 날, 488나노미터와 594나노미터 파장을 가진 컨포칼 현미경을 사용하여 관심 뇌 영역의 다중 채널 이미지를 획득합니다.
EcoHIV-mScarlet 신호는 주로 Tmem119-EGFP 마우스 뇌에서 EGFP로 표지된 미세아교세포에서 관찰되었습니다. EcoHIV-mScarlet으로 처리된 배양된 쥐의 뇌 세포에서는 심각한 신경 감염이 감지되지 않았습니다.
