פרוטוקול זה מתאר כיצד השילוב של זיהום EcoHIV עם עכברי Tmem119-EGFP מציע מערכת ביולוגית רבת ערך לחקירת שינויים במיקרוגליה ומאגרים נגיפיים במודלים של מכרסמים של הפרעות נוירו-קוגניטיביות הקשורות ל-HIV. טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב שיפר באופן דרמטי את איכות חייהם של אנשים החיים עם HIV. כדי להבין כיצד HIV משפיע על מערכת העצבים המרכזית, יש צורך במודל אמין ומעשי של HIV.
בעבר, מערכת ביולוגית חדשה המשתמשת ב-HIV כימרי, EcoHIV בקולציה פותחה במודל חולדות כדי לחקור ליקוי נוירו-קוגניטיבי ותפקוד סינפטי. אתגר משמעותי נותר בהבהרת ההתפלגות הנוירו-אנטומית של EcoHIV, במיוחד הביטוי הדיפרנציאלי שלו בסוגי תאים שונים במוח. במחקר הנוכחי, EcoHIV עם תיוג פלואורסצנטי mScarlet שונה והוזרק רטרו-אורביטלי לעכברי Tmem119-EGFP כדי לקבוע אם מיקרוגליה היא סוג התא העיקרי האחראי על ביטוי הנגיף ומאגר ה-HIV במוח.
כדי להתחיל, העבירו את תאי המוח של חולדות עובריות מנותקות לצלחת מצופה מראש של 12 בארות פולי-ליזין עם תוספות זכוכית המכילות מיליליטר אחד של DMEM-F12 בתוספת 10% FBS. דגרו על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת, החלף את המדיום במדיום נוירו-בזאלי בתוספת B27 והמשך בתרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שלושה שבועות.
לאחר מכן הוסיפו 60 מיקרוליטר של EcoHIV-mScarlet לתרבית תאי המוח ודגרו במשך שישה ימים. לאחר הדגירה, תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד. לבצע צביעה חיסונית על תאי מוח נגועים באמצעות נוגדנים ראשוניים ספציפיים ולדמות אותם במיקרוסקופ קונפוקלי תחת מטרה של פי 40.
מיקרוגליה זוהתה כסוג התא הנגוע העיקרי בתרביות תאי מוח של חולדות, כפי שמעידה קולוקליזציה של mScarlet עם סמני CD11b/c ו-Iba1. כדי להתחיל, פתחו את הקרקפת של עכבר בוגר ערוף ראש והעבירו את רקמת המוח לצלחת פטרי אחרת המכילה חמישה מיליליטר של HBSS מעוקר. מקלפים את קרומי המוח ומעבירים את קליפת המוח הקדמית לשני מיליליטר של HBSS.
לאחר מכן, הוסיפו לתערובת 20 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין-EDTA. דוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, מסובבים את הצינור כל כמה דקות. העבירו את התאים המנותקים לבקבוק מצופה מראש של 75 סנטימטר מרובע המכיל 10 מיליליטר של מדיום DMEM-F12 ו-10% FBS.
תרבית תאים בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עד שהם מגיעים למפגש של 90%. לאחר מכן, עכל את תאי המוח עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA. תת-תרבית של תאי המוח המעוכלים לצלחת זכוכית תחתונה של 35 מילימטר המכילה חמישה מיליליטר של מדיום גידול DMEM-F12 עד שהם מגיעים למפגש של 80%.
לאחר מכן הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של EcoHIV-mScarlet לתאי הגליה של העכבר ודגרו במשך יומיים. תאי גליה ראשוניים של עכברים בוגרים נדבקו בהצלחה על ידי EcoHIV-mScarlet לאחר יומיים של טיפול. כדי להתחיל, אבטח את עכבר ה-Tmem119-EGFP המורדם במצב רוחבי.
הפשירו את ה-EcoHIV-mScarlet על קרח. מלאו את התמיסה הנגיפית למזרק מזרק תוך עיני עם מחט קהה בגודל 33. הנח את העכבר בשכיבה הצדדית הימנית כשהראש פונה שמאלה.
זהה את אזור ההזרקה סביב אזור העיניים. יש להכניס לאט ובעדינות את המחט לתוך הקנטוס המדיאלי של העין. לאחר מכן קדם את המחט לתוך הכלים שמאחורי גלגל העין.
הזריק 6.5 מיקרוליטר של EcoHIV-mScarlet לתוך הסינוס הרטרו-אורביטלי. לאחר ההזרקה, הסר בזהירות את המחט. הנח את העכבר המורדם במצב שכיבה בתוך מכסה אדים כימי.
פתח את העור לאורך קו האמצע של בית החזה. ואז הפרד את הסרעפת ופתח את החזה במספריים. כעת הכנס מחט וחצי בגודל 22 לחדר השמאלי.
פתח את האטריום הימני עם מספריים. יש להחדיר את האטריום הימני ב-50 מיליליטר של PBS 100 מילי-מולר מקורר מראש, ולאחר מכן לחלחל ב-100 מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד מקורר מראש. הסר את כל מוח העכבר.
לאחר קיבוע המוח ב-4% פרפורמלדהיד, אבטח את רקמת המוח באמצעות דבק רקמות על פלטפורמת המתכת של הוויברטום. חותכים קטעי קורונל בעובי 50 מיקרומטר עם להבי פלדת פחמן. לאחר מכן, הניחו את פרוסות המוח על שקופיות זכוכית באמצעות מברשת.
הוסף מיד 0.1 מיליליטר של אמצעי הרכבה נגד דהייה לכל חלק. הניחו כיסוי בגודל 22 על 50 מילימטר על חלקי המוח וייבשו את מגלשות הסופרפרוסט בחושך למשך יום אחד. למחרת, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם אורכי גל של 488 ננומטר ו-594 ננומטר כדי להשיג תמונות רב-ערוציות של אזור העניין במוח.
אותות EcoHIV-mScarlet נצפו בעיקר בתאי מיקרוגליה המסומנים ב-EGFP במוח העכבר Tmem119-EGFP. לא זוהה זיהום עצבי משמעותי בתאי מוח של חולדות מתורבתים שטופלו ב-EcoHIV-mScarlet.
