Este protocolo descreve como a combinação da infecção por EcoHIV com camundongos Tmem119-EGFP oferece um sistema biológico valioso para investigar alterações microgliais e reservatórios virais em modelos de roedores de distúrbios neurocognitivos associados ao HIV. A terapia antirretroviral combinada melhorou drasticamente a qualidade de vida das pessoas que vivem com HIV. Para entender como o HIV afeta o sistema nervoso central, é necessário um modelo confiável e viável de HIV.
Anteriormente, um novo sistema biológico usando HIV quimérico, EcoHIV na colação, foi desenvolvido em modelo de rato para investigar comprometimento neurocognitivo e disfunção sináptica. Um desafio significativo permanece no esclarecimento da distribuição neuroanatômica do EcoHIV, particularmente sua expressão diferencial em vários tipos de células no cérebro. No estudo atual, o EcoHIV com marcação de fluorescência mScarlet foi modificado e injetado retroorbitalmente em camundongos knock-in Tmem119-EGFP para determinar se a microglia é o principal tipo de célula responsável pela expressão viral e o reservatório de HIV no cérebro.
Para começar, transfira as células cerebrais de ratos fetais dissociadas para uma placa pré-revestida de poli-L-lisina de 12 poços com inserções de vidro contendo um mililitro de DMEM-F12 mais 10% FBS. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, substitua o meio por um meio neurobasal suplementado com B27 e continue cultivando células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três semanas.
Em seguida, adicione 60 microlitros de EcoHIV-mScarlet na cultura de células cerebrais e incube por seis dias. Após a incubação, fixe as células com 4% de paraformaldeído. Realize imunocoloração em células cerebrais infectadas usando anticorpos primários específicos e visualize-os em um microscópio confocal sob uma objetiva de 40x.
A microglia foi identificada como o principal tipo de célula infectada em culturas de células cerebrais de ratos, como evidenciado pela colocalização de mScarlet com marcadores CD11b / c e Iba1. Para começar, abra o couro cabeludo de um camundongo adulto decapitado e transfira o tecido cerebral para outra placa de Petri contendo cinco mililitros de HBSS esterilizado. Retire as meninges e transfira o córtex frontal para dois mililitros de HBSS.
Em seguida, adicione 20 microlitros de 0,25% de tripsina-EDTA à mistura. Incube por 15 minutos em temperatura ambiente, girando o tubo a cada poucos minutos. Transfira as células dissociadas para um frasco pré-revestido de poli-L-lisina de 75 centímetros quadrados contendo 10 mililitros de meio DMEM-F12 e 10% de FBS.
Células de cultura em incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até atingirem 90% de confluência. Em seguida, digerir as células cerebrais com dois mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA. Subcultive as células cerebrais digeridas em um prato de fundo de vidro de 35 milímetros contendo cinco mililitros de meio de crescimento DMEM-F12 até atingirem 80% de confluência.
Em seguida, adicione oito microlitros de EcoHIV-mScarlet nas células gliais do camundongo e incube por dois dias. As células gliais primárias de camundongos adultos foram infectadas com sucesso pelo EcoHIV-mScarlet após dois dias de tratamento. Para começar, prenda o mouse Tmem119-EGFP anestesiado em uma posição lateral.
Descongele o EcoHIV-mScarlet no gelo. Encha a solução viral em uma seringa injetora intraocular com uma agulha romba de calibre 33. Coloque o mouse na posição de decúbito lateral direita com a cabeça voltada para a esquerda.
Identifique a área de injeção ao redor da região dos olhos. Insira lenta e suavemente a agulha no canto medial do olho. Em seguida, avance a agulha nos vasos atrás do globo ocular.
Injete 6,5 microlitros de EcoHIV-mScarlet no seio retro-orbital. Após a injeção, remova cuidadosamente a agulha. Coloque o mouse anestesiado em decúbito dorsal dentro de uma capela de exaustão química.
Abra a pele ao longo da linha média torácica. Em seguida, separe o diafragma e abra o peito com uma tesoura. Agora insira uma agulha e meia de calibre 22 no ventrículo esquerdo.
Abra o átrio direito com uma tesoura. Perfunda o átrio direito com 50 mililitros de PBS 100 milimolares pré-resfriados e, em seguida, perfunda com 100 mililitros de paraformaldeído a 4% pré-resfriado. Remova todo o cérebro do rato.
Depois de fixar o cérebro em 4% de paraformaldeído, prenda o tecido cerebral usando adesivo de tecido na plataforma de metal do vibratome. Corte cortes coronais de 50 micrômetros de espessura com lâminas de aço carbono. Em seguida, coloque as fatias de cérebro em lâminas de vidro usando um pincel.
Adicione imediatamente 0,1 mililitros de meio de montagem anti-desbotamento a cada seção. Coloque uma lamínula de 22 por 50 milímetros sobre as seções do cérebro e seque as lâminas Superfrost no escuro por um dia. No dia seguinte, use um microscópio confocal com comprimentos de onda de 488 nanômetros e 594 nanômetros para adquirir imagens multicanais da região cerebral de interesse.
Os sinais EcoHIV-mScarlet foram observados principalmente em células microgliais marcadas com EGFP no cérebro de camundongos Tmem119-EGFP. Nenhuma infecção neuronal significativa foi detectada em células cerebrais de ratos cultivadas tratadas com EcoHIV-mScarlet.
