نحن مهتمون بتحديد الأساس الجزيئي لاضطرابات النمو العصبي المرتبطة بالمتغيرات الجينية في إنزيمات نظام اليوبيكويتين. نستخدم أحدث التقنيات لتشريح مسارات الإشارات التي تتحكم فيها تلك الإنزيمات ولتحديد تأثير المتغيرات الجينية على بيولوجيا البروتين. تتمثل ميزة هذه الطريقة في أنها تقنية مستقلة عن الركيزة ولا تتطلب معرفة مسبقة بالركائز التي ينظمها DUB معين.
بهذه الطريقة يمكننا قياس تأثير التباين الجيني المرتبط باضطراب النمو العصبي بشكل مباشر على النشاط التحفيزي DUB واقتراح آليات مسببة للأمراض المحتملة. نظرا لأن الوظائف الخلوية لمعظم DUBs غير مفهومة جيدا ، فإن تركيزنا المختبري سينصب على تحديد مسارات الإشارات التي تتوسط فيها هذه الإنزيمات وكيف تؤثر المتغيرات الجينية المرتبطة بالأمراض الوراثية على هذه العمليات. للبدء ، قم بإذابة 20 ميكرولترا من خلايا Rosetta 2 Escherichia coli المختصة كيميائيا على الجليد مباشرة قبل الاستخدام.
أضف واحدا إلى 10 نانوجرام من بلازميد التعبير pGEX6P1 USP27X واحتضنه لمدة خمس دقائق على الجليد. صدمة حرارية للخلايا لمدة 30 ثانية عند 42 درجة مئوية في حمام جاف. ثم احتضان الخلايا على الجليد لمدة دقيقتين.
أضف 80 ميكرولترا من وسط SOC بدرجة حرارة الغرفة إلى الخلايا. احتضن لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع دوران 200 دورة في الدقيقة في شاكر يتم التحكم في درجة حرارته في مدار 19 ملم. ثم صفيحة 50 ميكرولتر من الثقافة على لوح أجار LB ، مكملة بالكلورامفينيكول والأمبيسلين.
احتضن لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية ، بحيث يكون جانب الغطاء لأسفل ، في حاضنة يتم التحكم في درجة حرارتها. اختر مستعمرة واحدة من البكتيريا المحولة وأضفها إلى 10 ملليلتر من وسط LB المعقم المكمل بالكلورامفينيكول والأمبيسلين. احتضن لمدة 20 ساعة كما هو موضح سابقا.
ثم أضف 10 ملليلتر من المزرعة الليلية إلى لتر واحد من وسط السل المكمل بالكلورامفينيكول والأمبيسيلين. احتضان حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى 0.5 إلى 0.6. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرومولار من الأيزوبروبيل بيتا -د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيد إلى المزرعة للحث على التعبير.
بعد تبريد العينة إلى 16 درجة مئوية ، احتضنها لمدة 20 ساعة عند 16 درجة مئوية مع دوران 200 دورة في الدقيقة. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 20 دقيقة عند 3000 جم أو أعلى عند أربع درجات مئوية لتكسير الخلايا من ثقافة التعبير. أخيرا, قم بتخزين الحبيبات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة على الأقل.
للبدء ، قم بتأمين عمود تدفق الجاذبية الفارغ في حامل معوجة. املأ العمود بملليلترتين إلى ثلاثة ملليلترات من راتنج الجلوتاثيون الاغاروز لتنقية حبيبات الخلية التي تم جمعها من لتر واحد من ثقافة التعبير. اغسل العمود بحجم سرير راتنج واحد بنسبة 20٪ من الإيثانول.
بعد غسل العمود ، قم بإذابة حبيبات الخلية عند أربع درجات مئوية. أضف 30 مل من المخزن المؤقت MS500 إلى الحبيبات المذابة واحتضنه بدوران لطيف من طرف إلى طرف. الآن صوتنة الخلايا المحللة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل على الجليد حتى يتدفق المحللة بحرية عند الاستغناء عنها من طرف الماصة.
جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية و 20،000 جم أو أعلى لإزالة المادة الطافية. ثم صب المادة الطافية في دورق وقم بتحميل المحللة التي تم تطهيرها على العمود. قم بتشغيل المحللة عبر العمود عن طريق تدفق الجاذبية أثناء جمع التدفق.
بعد ذلك ، اغسل العمود بحجمين على الأقل من الراتنج من المخزن المؤقت للغسيل MS500 واجمع تدفق الغسيل في خمسة أجزاء ملليلتر. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحدا من كل جزء إلى 100 ميكرولتر من كاشف برادفورد للتحقق من وجود البروتين. استرجع البروتين عن طريق تشغيل المخزن المؤقت للتخلص MS500 من خلال العمود وجمع خمسة أجزاء شطف مليلتر.
لترسيب البروتين ، أضف مجلدين من كبريتات الأمونيوم رباعية المولار إلى الشطف واقلب الأنبوب برفق حتى يصبح غائما. جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية و 20،000 جم أو أعلى. قم بإزالة المادة الطافية بعد كل طرد مركزي دون إزعاج حبيبات البروتين.
ثم أعد إذابة البروتين في المخزن المؤقت MS500 المكمل بنسبة 25٪ من الجلسرين قبل تخزينه. قم بإعداد 10 ميكرولترات من USP27X المنقى الموسوم بضريبة السلع والخدمات في مخزن مؤقت لتنشيط إنزيم deubiquitylating لكل نقطة زمنية لكل إنزيم deubiquitylating. قبل إضافة سلاسل يوبيكويتين ، أضف سبعة ميكرولترات من المخزن المؤقت لتحميل SDS-PAGE إلى عينة الوقت الصفرية لمنع تفاعل deubiquitylation من البدء.
إلى كل نقطة زمنية لكل إنزيم deubiquitylating ، أضف 375 نانوغراما من سلاسل di-ubiquitin المرتبطة ب K63 المخففة في 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتنشيط الإنزيم. احتضان الأنابيب عند 30 درجة مئوية ، وتوقف كل نقطة زمنية عن طريق إضافة سبعة ميكرولترات من المخزن المؤقت للتحميل SDS-PAGE. قم بإجراء SDS-PAGE باستخدام هلام متدرج من أربعة إلى 12٪.
شق النوع البري USP27X سلاسل di-ubiquitin المرتبطة ب K63 إلى أحادي يوبيكويتين بعد ساعة واحدة من الحضانة. لم يشق التباين المرتبط ب XLID-105 F313V و Y381H و S404N سلاسل di-ubiquitin المرتبطة ب K63 بعد ساعة واحدة من الحضانة.
