אנו מעוניינים להגדיר את הבסיס המולקולרי של הפרעות נוירו-התפתחותיות הקשורות לגרסאות גנטיות באנזימים של מערכת האוביקוויטין. אנו משתמשים בטכניקות חדשניות כדי לנתח את מסלולי האיתות הנשלטים על ידי אנזימים אלה ולקבוע את ההשפעה של וריאנטים גנטיים על ביולוגיה של חלבונים. יתרונה של שיטה זו הוא שמדובר בטכניקה שאינה תלויה במצע ואינה דורשת ידע מוקדם על המצעים המוסדרים על ידי DUB ספציפי.
בדרך זו אנו יכולים למדוד ישירות את ההשפעה של שונות גנטית הקשורה להפרעה נוירו-התפתחותית על הפעילות הקטליטית של DUB ולהציע מנגנונים פתוגניים אפשריים. מאחר שהתפקודים התאיים של רוב ה-DUBs אינם מובנים היטב, המעבדה שלנו תתמקד בזיהוי מסלולי האיתות שאנזימים אלה מתווכים וכיצד וריאנטים גנטיים הקשורים למחלות גנטיות משפיעים על תהליכים אלה. כדי להתחיל, הפשירו 20 מיקרוליטר של תאי רוזטה 2 Escherichia coli בעלי כשירות כימית על קרח מיד לפני השימוש.
הוסף אחד עד 10 ננוגרם של פלסמיד ביטוי pGEX6P1 USP27X ודגור במשך חמש דקות על קרח. חום לזעזע את התאים במשך 30 שניות ב 42 מעלות צלזיוס באמבטיה יבשה. לאחר מכן לדגור על התאים על קרח במשך שתי דקות.
הוסיפו 80 מיקרוליטר של SOC בינוני בטמפרטורת החדר לתאים. דגירה במשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב של 200 סל"ד בשייקר מבוקר טמפרטורה של מסלול 19 מ"מ. ואז צלחת 50 מיקרוליטר של התרבות על צלחת אגר LB, בתוספת chloramphenicol ו ampicillin.
דוגרים במשך 20 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם המכסה כלפי מטה, באינקובטור מבוקר טמפרטורה. בחר מושבה אחת של חיידקים מותמרים והוסף אותו 10 מיליליטר של מדיום LB סטרילי בתוספת chloramphenicol ו ampicillin. יש לדגור במשך 20 שעות כפי שהוצג קודם לכן.
לאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של תרבית לילה ליטר אחד של שחפת בינונית בתוספת chloramphenicol ו ampicillin. דוגרים עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה ל-0.5 עד 0.6. לאחר מכן, הוסף 50-micromolar isopropyl beta-d-1-thiogalactopyranoside לתרבית כדי לגרום לביטוי.
לאחר קירור הדגימה ל-16 מעלות צלזיוס, דוגרים במשך 20 שעות ב-16 מעלות צלזיוס עם סיבוב של 200 סל"ד. לאחר מכן צנטריפוגו את התאים למשך 20 דקות בטמפרטורה של 3000 גרם ומעלה בארבע מעלות צלזיוס כדי להוציא את התאים מתרבית הביטוי. לבסוף, לאחסן את הגלולה ב מינוס 80 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת.
כדי להתחיל, אבטח את עמודת זרימת הכבידה הריקה במעמד תגובה. מלאו את העמוד בשניים עד שלושה מיליליטרים של שרף גלותיון אגרוז כדי לטהר גלולת תא שנאספה מליטר אחד של תרבית ביטוי. שטפו את העמוד במצע שרף אחד בנפח 20% אתנול.
לאחר שטיפת העמוד, הפשירו את גלולת התא בארבע מעלות צלזיוס. הוסף 30 מיליליטר של מאגר MS500 לגלולה המופשרת ודגור בסיבוב עדין מקצה לקצה. כעת יש להסוניק את תאי הליזד בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר על קרח עד שהליזט זורם בחופשיות כאשר הוא מנופק מקצה פיפטה.
צנטריפוגה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ו 20, 000 גרם ומעלה כדי לנקות את supernatant. לאחר מכן מרוקנים את הסופרנאטנט לתוך ומעמיסים את הליזט המפונה על העמוד. הפעל את הליזט דרך הטור על ידי זרימת כוח הכבידה תוך איסוף הזרימה.
לאחר מכן, שטפו את העמוד עם לפחות שני נפחי מיטת שרף של מאגר כביסה MS500 ואספו את זרימת הכביסה בשברים של חמישה מיליליטר. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד מכל שבר ל -100 מיקרוליטר של מגיב ברדפורד כדי לבדוק נוכחות חלבון. שחזר את החלבון על-ידי הפעלת מאגר חמקמק MS500 דרך העמודה ואיסוף שברים של חמישה מיליליטר אלוציה.
כדי לזרז את החלבון, הוסיפו שני כרכים של אמוניום סולפט בעל ארבע טוחנות לצינור והפכו בעדינות את הצינור עד שהוא הופך לעכור. צנטריפוגה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ו 20, 000 גרם ומעלה. מוציאים את הסופרנאטנט אחרי כל צנטריפוגה בלי להפריע לכדורית החלבון.
לאחר מכן יש להמיס מחדש את החלבון במאגר MS500 בתוספת 25% גליצרול לפני אחסונו. הכינו 10 מיקרוליטר של USP27X מטוהר עם תווית GST במאגר הפעלת אנזים deubiquitylating עבור כל נקודת זמן עבור כל אנזים deubiquitylating. לפני הוספת שרשראות יוביקוויטין, הוסף שבעה מיקרוליטרים של מאגר טעינה SDS-PAGE לדגימת זמן אפס כדי למנוע את התחלת תגובת הדוביקוויטילציה.
לכל נקודת זמן עבור כל אנזים דאוביקוויטילציה, הוסף 375 ננוגרם של שרשראות די-יוביקוויטין מקושרות K63 המדוללות ב-10 מיקרוליטר של מאגר הפעלת אנזים. דגרו על הצינורות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, ועצרו בכל נקודת זמן על ידי הוספת שבעה מיקרוליטרים של מאגר טעינה SDS-PAGE. בצע SDS-PAGE באמצעות ג'ל הדרגתי של 4% עד 12%.
סוג פראי USP27X חתך שרשראות די-יוביקוויטין מקושרות K63 למונו-יוביקוויטין לאחר שעה של דגירה. הגרסאות המשויכות ל-XLID-105 F313V, Y381H ו-S404N לא ניתקו שרשראות די-יוביקוויטין מקושרות K63 לאחר שעה אחת של דגירה.
