يركز البحث في مختبري على فهم الآليات الأساسية التي تعزز إجهاد العضلات لدى مرضى سرطان الثدي. على وجه التحديد ، نريد أن نفهم التواصل بين الورم الموضعي في أنسجة الثدي والعضلات الهيكلية الطرفية ، ثم الاستجابات الجزيئية داخل تلك العضلة التي تؤدي إلى التعب. يتيح تطوير نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد دراسات عالية الإنتاجية حيث يمكن دراسة الاستجابات الوظيفية مثل إجهاد العضلات في ظل ظروف خاضعة للرقابة.
يمكن إجراء تجارب زراعة الخلايا الوظيفية بالتوازي وتتطلب وقتا أقل من النماذج الحيوانية المكافئة ، مما يسهل الاكتشاف السريع والابتكار. إن تقييم الأنماط الظاهرية الوظيفية ذات الصلة باستخدام نماذج الطعم الغريب التقليدية المشتقة من المريض يستغرق وقتا طويلا وكثيف الموارد. يسهل هذا البروتوكول الحقن المتزامن ل PDXs في الفئران ، مما يسمح للباحثين بدراسة الاستجابات الجهازية للأورام البشرية باستخدام تجارب حيوانية جيدة الطاقة.
يسمح هذا البروتوكول بالحقن التقويمي لخلايا ورم الثدي المشتقة من المريض على نطاق محسن على الطرق الحالية مما يسهل الحقن السريع لما يصل إلى عشرات الفئران يوميا من قبل باحث واحد. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي تفكك الورم إلى إنشاء تعليق خلوي متجانس يوزع أنواع الخلايا بالتساوي بين. حددت البيانات من مختبري استجابات جزيئية عضلية مماثلة لسرطان الثدي في فأر PDX ومرضى السرطان البشريين.
لذلك ، نريد استخدام نموذج الفأر قبل السريري هذا لفحص الأدوية المرشحة وتحديد العلاجات التي يمكن أن تخفف من التعب لدى مرضى سرطان الثدي. للبدء ، قم بإذابة الإنزيمات H و R و A من مجموعة تفكك الورم البشري. أضف 200 ميكرولتر من إنزيم H و 100 ميكرولتر من إنزيم R و 25 ميكرولتر من الإنزيم A في أنبوب معقم C.أضف 4.7 مل من وسط RPMI 1640 المعقم إلى الأنبوب C لضبط الحجم النهائي إلى حوالي خمسة ملليلتر.
ثم انقل شظايا الورم المذابة ووسط التجميد المصاحب إلى نصف طبق ثقافة معقم مقاس 100 ملم. باستخدام ملقط معقم ، انقل شظايا الورم إلى أنبوب دقيق معقم سعة خمسة ملليلتر واغسلها بواحد إلى ثلاثة ملليلتر من PBS المعقم. باستخدام ملقط معقم ، انقل الأجزاء المطهرة إلى أنبوب صغير جديد سعة خمسة ملليلتر.
بعد الغسيل الثاني باستخدام PBS المعقم ، انقل الأجزاء إلى النصف الجاف من طبق الثقافة 100 ملم. باستخدام شفرات مشرط معقمة رقم 10 ، قم بفرم أنسجة الورم جيدا. انقل شظايا الورم المفرومة إلى شفرة واحدة وقم بإيداعها في الأنبوب C الذي يحتوي على محلول الإنزيم المحضر.
اقلب الأنبوب C عدة مرات لضمان التوزيع المتساوي لشظايا الورم داخل محلول الإنزيم. الآن ضع الأنبوب C في جهاز الفصل الميكانيكي واقلب الأنبوب للتأكد من غمر جميع المحتويات في الوسط. حدد برنامج 37CHTDK3 من واجهة شاشة اللمس.
عند الانتهاء من برنامج التفكك ، افحص محتويات الأنبوب. بمجرد تحقيق التفكك الكافي ، قم بالطرد المركزي للأنبوب C عند 200G لمدة خمس إلى ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية. باستخدام الشفط الفراغي أو الماصة ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في RPMI 1640 إلى حجم يعادل نصف حجم الحقن النهائي المطلوب.
في أنبوب الطرد المركزي الصغير ذو القاع المستدير سعة ملليلترين ، اجمع الكمية المطلوبة من تعليق الخلية المخفف في RPMI مع حجم متساو من Matrigel. امزج المعلق برفق عن طريق سحب العينات المتكرر لضمان التجانس. للبدء ، قم بفصل أورام الثدي البشرية إلى معلق أحادي الخلية.
بعد ذلك ، باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد بدون إبرة متصلة ، قم بشفط تعليق الخلية برفق لأعلى ولأسفل لضمان التجانس. قم بتوصيل إبرة قياس 26 بالمحقنة واسحب حجم الحقن المطلوب. ثم اضغط برفق على المحقنة أو انقر فوقها للتخلص من أي فقاعات هواء.
ضعي طبقة رقيقة من كريم إزالة الشعر على موقع الحقن المستهدف على الماوس. بعد تنظيف منطقة الحقن ، أمسك الجلد الظهري بإحكام في مؤخرة العنق والخلف لكبح جماح الماوس بشكل آمن ووضع الفأر في وضع ضعيف. أدخل الإبرة بزاوية 45 درجة تشير إلى الورك حوالي 0.5 إلى سنتيمتر واحد ذيلية إلى وسادة الدهون ، مع ضبط طول الإبرة.
تقدم الإبرة إلى وسادة الدهون ، وبطريقة خاضعة للرقابة ، قم بحقن الحجم المطلوب من تعليق الخلية. بعد الحقن ، قم بتدوير الإبرة 180 درجة وحافظ على الوضع لفترة وجيزة قبل سحبها ببطء لتقليل فقدان الخلايا من موقع الحقن.
