A pesquisa em meu laboratório está focada na compreensão dos mecanismos subjacentes que promovem a fadiga muscular em pacientes com câncer de mama. Especificamente, queremos entender a comunicação entre um tumor localizado no tecido mamário com o músculo esquelético periférico e, em seguida, as respostas moleculares dentro desse músculo que levam à fadiga. O desenvolvimento de modelos de cultura de células 3D está permitindo estudos de alto rendimento onde respostas funcionais, como fadiga muscular, podem ser estudadas sob condições controladas.
Os experimentos de cultura de células funcionais podem ser conduzidos em paralelo e requerem menos tempo do que os modelos animais equivalentes, facilitando a rápida descoberta e inovação. A avaliação de fenótipos funcionais relevantes usando modelos tradicionais de xenoenxerto derivados de pacientes é demorada e consome muitos recursos. Este protocolo facilita a injeção simultânea de PDXs em camundongos, permitindo que os pesquisadores estudem as respostas sistêmicas a tumores humanos usando experimentos com animais bem alimentados.
Este protocolo permite a injeção ortotópica de células tumorais de mama derivadas de pacientes em uma escala aprimorada em relação aos métodos existentes, facilitando a injeção rápida de até várias dezenas de camundongos por dia por um único pesquisador. Além disso, a dissociação do tumor gera uma suspensão celular homogênea que distribui uniformemente os tipos de células entre os animais. Os dados do meu laboratório identificaram respostas moleculares musculares semelhantes ao câncer de mama em camundongos PDX e pacientes com câncer humano.
Portanto, queremos utilizar este modelo de camundongo pré-clínico para rastrear medicamentos candidatos e identificar terapias com potencial para mitigar a fadiga em pacientes com câncer de mama. Para começar, descongele as enzimas H, R e A do kit de dissociação de tumores humanos. Adicione 200 microlitros de enzima H, 100 microlitros de enzima R e 25 microlitros de enzima A em um tubo estéril C.Adicione 4,7 mililitros de meio estéril RPMI 1640 ao tubo C para ajustar o volume final para aproximadamente cinco mililitros.
Em seguida, transfira os fragmentos de tumor descongelados e o meio de congelamento que os acompanha para a metade de uma placa de cultura estéril de 100 milímetros. Usando uma pinça estéril, transfira os fragmentos do tumor para um microtubo estéril de cinco mililitros e lave-os com um a três mililitros de PBS estéril. Usando uma pinça estéril, transfira os fragmentos desinfetados para um novo microtubo de cinco mililitros.
Após uma segunda lavagem com PBS estéril, transfira os fragmentos para a metade seca da placa de cultura de 100 milímetros. Usando duas lâminas de bisturi estéreis número 10, pique bem o tecido tumoral. Transfira os fragmentos tumorais picados para uma lâmina e deposite-os no tubo C contendo a solução enzimática preparada.
Inverta o tubo C várias vezes para garantir uma distribuição uniforme dos fragmentos tumorais dentro da solução enzimática. Agora coloque o tubo C no dissociador mecânico e inverta o tubo para garantir que todo o conteúdo esteja submerso no meio. Selecione o programa 37CHTDK3 na interface da tela sensível ao toque.
Após a conclusão do programa de dissociação, inspecione o conteúdo do tubo. Uma vez alcançada a dissociação adequada, centrifugue o tubo C a 200G por cinco a oito minutos a quatro graus Celsius. Usando aspiração a vácuo ou uma pipeta, remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em RPMI 1640 até um volume equivalente à metade do volume final de injeção desejado.
Em um tubo de microcentrífuga de fundo redondo de dois mililitros, combine a quantidade desejada de suspensão de célula diluída em RPMI com um volume igual de Matrigel. Misture suavemente a suspensão por pipetagem repetida para garantir a homogeneidade. Para começar, dissocie os tumores de mama humanos em uma suspensão de célula única.
Em seguida, usando uma seringa de um mililitro sem agulha acoplada, aspire suavemente a suspensão celular para cima e para baixo para garantir a homogeneidade. Coloque uma agulha de calibre 26 na seringa e retire o volume de injeção desejado. Em seguida, bata suavemente ou mova a seringa para eliminar quaisquer bolhas de ar.
Aplique uma fina camada de creme depilatório no local da injeção alvo no rato. Depois de limpar a área de injeção, segure a pele dorsal firmemente na nuca e nas costas para conter firmemente o mouse e coloque-o em decúbito dorsal. Insira a agulha em um ângulo de 45 graus apontando para o quadril aproximadamente 0.5 a um centímetro caudal à almofada de gordura, ajustando o comprimento da agulha.
Avance a agulha na almofada de gordura e, de forma controlada, injete o volume desejado de suspensão celular. Após a injeção, gire a agulha 180 graus e mantenha a posição brevemente antes de retirá-la lentamente para minimizar a perda de células do local da injeção.
