Исследования в моей лаборатории сосредоточены на понимании основных механизмов, способствующих мышечной усталости у пациентов с раком молочной железы. В частности, мы хотим понять связь между опухолью, локализованной в ткани молочной железы, с периферическими скелетными мышцами, а затем молекулярные реакции внутри этой мышцы, которые приводят к усталости. Разработка 3D-моделей клеточных культур позволяет проводить высокопроизводительные исследования, в которых функциональные реакции, такие как мышечная усталость, могут быть изучены в контролируемых условиях.
Эксперименты с функциональными клеточными культурами могут проводиться параллельно и требуют меньше времени, чем эквивалентные животные модели, что способствует быстрым открытиям и инновациям. Оценка соответствующих функциональных фенотипов с использованием традиционных моделей ксенотрансплантатов, полученных от пациента, является трудоемкой и ресурсоемкой. Этот протокол облегчает одновременную инъекцию PDX мышам, позволяя исследователям изучать системные реакции на опухоли человека с помощью экспериментов на животных.
Этот протокол позволяет проводить ортотопические инъекции клеток опухоли молочной железы, полученных от пациента, в улучшенном масштабе по сравнению с существующими методами, что способствует быстрой инъекции до нескольких десятков мышей в день одним исследователем. Кроме того, диссоциация опухоли приводит к образованию однородной клеточной суспензии, которая равномерно распределяет типы клеток между животными. Данные моей лаборатории выявили схожие мышечные молекулярные реакции на рак молочной железы у мышей PDX и пациентов с раком человека.
Поэтому мы хотим использовать эту доклиническую мышиную модель для скрининга потенциальных препаратов и определения методов лечения, которые могут снизить усталость у пациентов с раком молочной железы. Для начала разморозьте ферменты H, R и A из набора для диссоциации опухолей человека. Добавьте 200 микролитров фермента H, 100 микролитров фермента R и 25 микролитров фермента A в стерильную пробирку C. Добавьте 4,7 миллилитра стерильной среды RPMI 1640 в пробирку C, чтобы довести итоговый объем примерно до пяти миллилитров.
Затем переложите размороженные фрагменты опухоли и сопутствующую замораживающую среду на одну половину стерильной 100-миллиметровой чашки для культивирования. С помощью стерильных щипцов перенесите фрагменты опухоли в стерильную пятимиллилитровую микропробирку и промойте их одним-тремя миллилитрами стерильного PBS. С помощью стерильных щипцов перенесите обеззараженные фрагменты в новую пятимиллилитровую микротрубку.
После повторной промывки стерильным ПБС переложите фрагменты в сухую половину 100-миллиметровой чашки для культуры. С помощью двух стерильных лезвий скальпеля No 10 тщательно измельчите опухолевую ткань. Перенесите измельченные фрагменты опухоли на одно лезвие и поместите их в С-образную трубку, содержащую приготовленный раствор фермента.
Несколько раз переверните С-образную трубку, чтобы обеспечить равномерное распределение фрагментов опухоли в растворе фермента. Теперь поместите трубку C в механический диссоциатор и переверните трубку, чтобы убедиться, что все содержимое погружено в среду. Выберите программу 37CHTDK3 в интерфейсе сенсорного экрана.
По завершении программы диссоциации осмотрите содержимое пробирки. Как только будет достигнута достаточная диссоциация, центрифугируйте С-трубку при 200 G в течение пяти-восьми минут при четырех градусах Цельсия. С помощью вакуумной аспирации или пипетки осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в RPMI 1640 до объема, эквивалентного половине желаемого конечного объема инъекции.
В двухмиллилитровой микроцентрифужной пробирке с круглым дном смешайте желаемое количество разбавленной клеточной суспензии в RPMI с равным объемом Matrigel. Аккуратно перемешайте суспензию путем повторного пипетирования для обеспечения однородности. Для начала диссоциируйте опухоли молочной железы человека в одноклеточную суспензию.
Затем с помощью одномиллилитрового шприца без прикрепленной иглы аккуратно отсасывайте клеточную суспензию вверх и вниз, чтобы обеспечить однородность. Прикрепите к шприцу иглу 26-го калибра и извлеките желаемый объем инъекции. Затем осторожно постучайте по шприцу, чтобы удалить пузырьки воздуха.
Нанесите тонкий слой крема для депиляции на целевое место инъекции на мыши. После очистки области инъекции крепко возьмитесь за тыльную сторону кожи на затылке и спине, чтобы надежно зафиксировать мышь и поместить мышь в лежачее положение. Введите иглу под углом 45 градусов, направленную к бедру примерно на 0,5-1 сантиметр каудально к жировой подушке, регулируя длину иглы.
Введите иглу в жировую подушку и контролируемым образом введите желаемый объем клеточной суспензии. После инъекции поверните иглу на 180 градусов и ненадолго сохраните положение, прежде чем медленно вытащить ее, чтобы свести к минимуму потерю клеток в месте инъекции.
