La ricerca nel mio laboratorio è focalizzata sulla comprensione dei meccanismi sottostanti che promuovono l'affaticamento muscolare nei pazienti con carcinoma mammario. In particolare, vogliamo capire la comunicazione tra un tumore localizzato nel tessuto mammario con il muscolo scheletrico periferico, e quindi le risposte molecolari all'interno di quel muscolo che portano all'affaticamento. Lo sviluppo di modelli 3D di colture cellulari sta consentendo studi ad alto rendimento in cui le risposte funzionali come l'affaticamento muscolare possono essere studiate in condizioni controllate.
Gli esperimenti di coltura cellulare funzionale possono essere condotti in parallelo e richiedono meno tempo rispetto ai modelli animali equivalenti, facilitando una rapida scoperta e innovazione. La valutazione dei fenotipi funzionali rilevanti utilizzando i tradizionali modelli di xenotrapianto derivati da pazienti richiede molto tempo e risorse. Questo protocollo facilita l'iniezione simultanea di PDX nei topi, consentendo ai ricercatori di studiare le risposte sistemiche ai tumori umani utilizzando esperimenti su animali ben potenziati.
Questo protocollo consente l'iniezione ortotopica di cellule tumorali mammarie derivate da pazienti su una scala migliore rispetto ai metodi esistenti, facilitando l'iniezione rapida di un massimo di diverse dozzine di topi al giorno da parte di un singolo ricercatore. Inoltre, la dissociazione del tumore genera una sospensione cellulare omogenea che distribuisce uniformemente i tipi di cellule tra gli animali. I dati del mio laboratorio hanno identificato risposte molecolari muscolari simili al cancro al seno nel topo PDX e nei pazienti con cancro umano.
Pertanto, vogliamo utilizzare questo modello murino preclinico per lo screening di farmaci candidati e identificare terapie con il potenziale di mitigare l'affaticamento nei pazienti con carcinoma mammario. Per iniziare, scongelare gli enzimi H, R e A dal kit di dissociazione del tumore umano. Aggiungere 200 microlitri di enzima H, 100 microlitri di enzima R e 25 microlitri di enzima A in una provetta sterile C.Aggiungere 4,7 millilitri di terreno sterile RPMI 1640 alla provetta C per regolare il volume finale a circa cinque millilitri.
Quindi trasferire i frammenti tumorali scongelati e il mezzo di congelamento che li accompagna su una metà di un piatto di coltura sterile da 100 millimetri. Utilizzando una pinza sterile, trasferire i frammenti tumorali in una microprovetta sterile da cinque millilitri e lavarli con uno o tre millilitri di PBS sterile. Utilizzando una pinza sterile, trasferire i frammenti disinfettati in una nuova microprovetta da cinque millilitri.
Dopo un secondo lavaggio con PBS sterile, trasferire i frammenti nella metà asciutta della piastra di coltura da 100 millimetri. Utilizzando due lame di bisturi sterili numero 10, tritare accuratamente il tessuto tumorale. Trasferire i frammenti tumorali tritati su una lama e depositarli nella provetta C contenente la soluzione enzimatica preparata.
Capovolgere più volte la provetta C per garantire una distribuzione uniforme dei frammenti tumorali all'interno della soluzione enzimatica. Ora posiziona il tubo C nel dissociatore meccanico e capovolgi il tubo per assicurarti che tutto il contenuto sia immerso nel fluido. Selezionare il programma 37CHTDK3 dall'interfaccia touchscreen.
Al termine del programma di dissociazione, ispezionare il contenuto del tubo. Una volta raggiunta un'adeguata dissociazione, centrifugare la provetta C a 200 G per cinque-otto minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando l'aspirazione a vuoto o una pipetta, rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet di cellule in RPMI 1640 a un volume equivalente alla metà del volume di iniezione finale desiderato.
In una provetta da microcentrifuga a fondo tondo da due millilitri, combinare la quantità desiderata di sospensione cellulare diluita in RPMI con un volume uguale di Matrigel. Miscelare delicatamente la sospensione mediante pipettaggio ripetuto per garantire l'omogeneità. Per iniziare, dissociare i tumori al seno umani in una sospensione a cellula singola.
Quindi, utilizzando una siringa da un millilitro senza ago inserito, aspirare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per garantire l'omogeneità. Collegare un ago calibro 26 alla siringa e prelevare il volume di iniezione desiderato. Quindi picchiettare delicatamente o muovere la siringa per eliminare eventuali bolle d'aria.
Applicare uno strato sottile di crema depilatoria sul sito di iniezione target sul topo. Dopo aver pulito l'area di iniezione, afferrare saldamente la pelle dorsale sulla nuca e sulla schiena per trattenere saldamente il topo e posizionare il topo in posizione supina. Inserire l'ago con un angolo di 45 gradi rivolto verso l'anca a circa 0,5-un centimetro caudale rispetto al cuscinetto adiposo, regolando la lunghezza dell'ago.
Far avanzare l'ago nel cuscinetto adiposo e, in modo controllato, iniettare il volume desiderato di sospensione cellulare. Dopo l'iniezione, ruotare l'ago di 180 gradi e mantenere brevemente la posizione prima di ritirarlo lentamente per ridurre al minimo la perdita di cellule dal sito di iniezione.
