Die Forschung in meinem Labor konzentriert sich auf das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen, die die Muskelermüdung bei Patientinnen mit Brustkrebs fördern. Insbesondere wollen wir die Kommunikation zwischen einem im Brustgewebe lokalisierten Tumor und der peripheren Skelettmuskulatur und den molekularen Reaktionen innerhalb dieses Muskels, die zu Ermüdung führen, verstehen. Die Entwicklung von 3D-Zellkulturmodellen ermöglicht Hochdurchsatzstudien, bei denen funktionelle Reaktionen wie Muskelermüdung unter kontrollierten Bedingungen untersucht werden können.
Funktionelle Zellkulturexperimente können parallel durchgeführt werden und benötigen weniger Zeit als vergleichbare Tiermodelle, was eine schnelle Entdeckung und Innovation ermöglicht. Die Bewertung relevanter funktioneller Phänotypen mit herkömmlichen patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen ist sowohl zeit- als auch ressourcenintensiv. Dieses Protokoll erleichtert die gleichzeitige Injektion von PDXs in Mäuse und ermöglicht es den Forschern, systemische Reaktionen auf menschliche Tumore mit Hilfe von gut durchgeführten Tierversuchen zu untersuchen.
Dieses Protokoll ermöglicht die orthotope Injektion von Brusttumorzellen von Patientinnen in einem verbesserten Maßstab als bestehende Methoden, was eine schnelle Injektion von bis zu mehreren Dutzend Mäusen pro Tag durch einen einzigen Forscher ermöglicht. Zusätzlich entsteht durch die Dissoziation des Tumors eine homogene Zellsuspension, die die Zelltypen gleichmäßig auf die Tiere verteilt. Daten aus meinem Labor haben ähnliche molekulare Muskelreaktionen auf Brustkrebs bei PDX-Maus- und menschlichen Krebspatientinnen identifiziert.
Daher wollen wir dieses präklinische Mausmodell nutzen, um Wirkstoffkandidaten zu screenen und Therapien zu identifizieren, die das Potenzial haben, Müdigkeit bei Patientinnen mit Brustkrebs zu mildern. Tauen Sie zunächst die Enzyme H, R und A aus dem humanen Tumordissoziationskit auf. Geben Sie 200 Mikroliter Enzym H, 100 Mikroliter Enzym R und 25 Mikroliter Enzym A in ein steriles Röhrchen C.Geben Sie 4,7 Milliliter steriles RPMI 1640 Medium in das C-Röhrchen, um das endgültige Volumen auf etwa fünf Milliliter einzustellen.
Anschließend überträgst du die aufgetauten Tumorfragmente und das dazugehörige Gefriermedium auf eine Hälfte einer sterilen 100-Millimeter-Kulturschale. Übertragen Sie die Tumorfragmente mit einer sterilen Pinzette in ein steriles Fünf-Milliliter-Mikroröhrchen und waschen Sie sie mit ein bis drei Millilitern sterilem PBS. Mit einer sterilen Pinzette werden die desinfizierten Fragmente in ein neues Fünf-Milliliter-Mikroröhrchen überführt.
Nach einer zweiten Wäsche mit sterilem PBS geben Sie die Fragmente in die trockene Hälfte der 100-Millimeter-Kulturschale. Mit zwei sterilen Skalpellklingen der Nummer 10 wird das Tumorgewebe gründlich zerkleinert. Übertragen Sie die zerkleinerten Tumorfragmente auf eine Klinge und legen Sie sie in das C-Röhrchen mit der vorbereiteten Enzymlösung.
Drehen Sie das C-Rohr mehrmals um, um eine gleichmäßige Verteilung der Tumorfragmente in der Enzymlösung zu gewährleisten. Setzen Sie nun das C-Rohr in den mechanischen Dissoziator ein und drehen Sie das Rohr um, um sicherzustellen, dass der gesamte Inhalt in das Medium eingetaucht ist. Wählen Sie das Programm 37CHTDK3 über die Touchscreen-Oberfläche aus.
Überprüfen Sie nach Abschluss des Dissoziationsprogramms den Inhalt der Röhre. Sobald eine ausreichende Dissoziation erreicht ist, zentrifugieren Sie das C-Rohr bei 200 G für fünf bis acht Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie mit einer Vakuumaspiration oder einer Pipette vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie das Küvettenpellet in RPMI 1640 wieder auf ein Volumen, das der Hälfte des gewünschten endgültigen Injektionsvolumens entspricht.
Kombinieren Sie in einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden die gewünschte Menge verdünnter Zellsuspension in RPMI mit einem gleichen Volumen Matrigel. Mischen Sie die Suspension vorsichtig durch wiederholtes Pipettieren, um die Homogenität zu gewährleisten. Dissoziieren Sie zunächst menschliche Brusttumoren in eine Einzelzellsuspension.
Anschließend wird die Zellsuspension mit einer Ein-Milliliter-Spritze ohne aufgesetzte Nadel sanft auf und ab abgesaugt, um die Homogenität zu gewährleisten. Befestigen Sie eine 26-Gauge-Nadel an der Spritze und entnehmen Sie das gewünschte Injektionsvolumen. Klopfen oder schnippen Sie dann vorsichtig auf die Spritze, um Luftblasen zu entfernen.
Tragen Sie eine dünne Schicht Enthaarungscreme auf die Zielinjektionsstelle der Maus auf. Fassen Sie nach der Reinigung des Injektionsbereichs die Rückenhaut fest im Nacken und am Rücken an, um die Maus sicher festzuhalten und in Rückenlage zu bringen. Führen Sie die Nadel in einem 45-Grad-Winkel in Richtung Hüfte etwa 0,5 bis 1 Zentimeter kaudal zum Fettpolster ein und passen Sie die Nadellänge an.
Führen Sie die Nadel in das Fettpolster ein und injizieren Sie kontrolliert das gewünschte Volumen der Zellsuspension. Drehen Sie die Nadel nach der Injektion um 180 Grad und halten Sie die Position kurz, bevor Sie sie langsam zurückziehen, um den Zellverlust von der Injektionsstelle zu minimieren.
