نود أن نعترف الروح التعاونية لجميع أفراد مختبر كالدويل. وقد مولت وجائزة باسل أوكونور الباحث العلمي من مارس من الدايمات وجائزة المهنة من مؤسسة العلوم الوطنية في GAC ، فضلا عن بحوث العلوم الجامعية برنامج منحة من معهد هوارد هيوز الطبي في جامعة ألاباما ، واستثارة العصبية البحث الصرع في مختبر كالدويل.

الألديكارب التعرض بارادايم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم الأول ، وضمان أن لا يقل عن ثلاثين مرحلة الشباب البالغين الديدان كل الوراثي وتكرار كل ستتوفر لفحوصات الألديكارب في اليوم الثاني. فمن الأفضل إذا كان يختار المجرب خمسين أو أكثر الديدان المرحلة L4 على لوحات NGM الطازجة (بدون النيستاتين أفضل) ، والتي تحتوي E. القولونية (يفضل OP50) كمصدر للغذاء ، وتنمو عليها ل12-24 ساعة عند درجة حرارة ثابتة والإباحية (20 درجة مئوية إلى 22 درجة مئوية هو أفضل ، على الرغم من أن درجة حرارة 25 مئوية على ما يرام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم الثاني ، وجعل أسهم 100 ملم حل الألديكارب الايثانول مع 70 ٪ (EtOH) و 30 ٪ DDH 2 O. انتشار كمية مناسبة من الألديكارب على لوحات NGM ناقص النيستاتين مع وحدات التخزين المحددة لتحقيق تركيزات الألديكارب المطلوب. نحن باستمرار استخدام الألديكارب 0.5 مم الطلاء 37.5 ميكرولتر من الألديكارب 100 ملم على 7.5 مل لوحات NGM. السماح لوحات الألديكارب لتجف لمدة 30-60 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة. ليس من الضروري للقضاء على هذه الأغطية. بدلا من ذلك ، يمكن إضافة إلى الألديكارب NGM وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد. &nbsp;</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التجفيف ، لوحة متناسقة من وحدات التخزين E. القولونية (يفضل OP50) على مركز كل لوحة الألديكارب وجافة لمدة دقيقتين 30-60 في درجة حرارة الغرفة. نحن باستمرار لوحة 25 ميكرولتر من OP50 ، مما يخلق الحشيش الغذاء الحجم بما فيه الكفاية للحفاظ على الديدان تتركز في بقعة صغيرة من دون الاكتظاظ. &nbsp;</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما العشب الغذائية الجافة ، ويمكن للمرء أن المضي قدما في المقايسات الألديكارب. نظرا لطبيعة الشخصية للفحوصات الألديكارب ، يوصى بشدة أن يكون أجرى تجارب &quot;عمياء&quot;. ويمكن لزميل المجرب الأولية إعادة تسمية لوحات أصلية مع الديدان أن يعاير. وبالمثل ، يمكن نقل الزميل الديدان من اللوحات الأصلية لوحات الألديكارب مشفر مباشرة قبل بدء الموقت. إذا المجرب تتوقع يعاير سلالة معينة من الديدان مع النمط الظاهري مميزة ، مثل uncoordination ، ثم يجب أن يكون هناك أيضا عنصر تحكم مع النمط الظاهري مماثلة للحد من التحيز. وعلاوة على ذلك ، فمن الأفضل إذا المجرب المقايسات سلالة من النوع البري ، فضلا عن سلالة مقاومة شديدة الحساسية والتوتر ، بالتوازي مع المساعدة على توحيد التجارب. يجب أن نسعى جاهدين لالمجرب تحليل عدد ثابت من الديدان لكل تكرار. نحن نحلل على الدوام thirty الديدان من النمط الجيني واحدة لكل تكرار. نقوم ايضا على الاقل ثلاثة مكررات لكل تجربة. يجب على خبرة المجرب يكون قادرا على تحليل لا يقل عن ستة سلالات في وقت واحد. &nbsp;</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من الديدان التي شلت الحث على نحو يتفق مع كل دودة سلك البلاتين. نحن لدينا همز باستمرار الديدان مرتين في الرأس والذيل مرتين في كل 30 دقيقة ليصبح المجموع ثلاث ساعات. ويمكن أيضا وقف ضخ البلعوم يمكن استخدامها لتحديد الشلل ، ولكن فقط إذا كان مجرب يعمل على تعريف ثابت من الشلل على جميع المقايسات. أيضا ، تجدر الإشارة إلى أن بعض الديدان ، وخاصة تلك التي تقاوم الألديكارب ، قد يحاول الزحف بعيدا عن اللوحة. في هذه الحالة ، قد انتشرت المجرب مبلغ ثابت من الحمض النخيلي ، وهو حاجز مادي لتنقل الدودة ، حول لوحات الألديكارب. نحن انتشار 25 ميكرولتر من 10 ملغ حمض EtOH / مل بالميتيك. </li></ol> PTZ التعرض بارادايم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم الأول ، وضمان أن لا يقل عن ثلاثين مرحلة الشباب البالغين الديدان كل الوراثي وتكرار كل ستتوفر لفحوصات PTZ في اليوم الثاني. فمن الأفضل إذا كان يختار المجرب خمسين أو أكثر الديدان المرحلة L4 على لوحات NGM الطازجة (بدون النيستاتين أفضل) ، والتي تحتوي E. القولونية (يفضل OP50) كمصدر للغذاء ، وتنمو عليها ل12-24 ساعة عند درجة حرارة ثابتة والإباحية (20 درجة مئوية إلى 22 درجة مئوية هو أفضل ، على الرغم من أن درجة حرارة 25 مئوية على ما يرام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم الثاني ، وجعل PTZ 0.5 غرام / مليلتر DDH الأسهم O 2 حل PTZ. انتشار كمية مناسبة من PTZ على NGM ناقص لوحات النيستاتين مع وحدات التخزين المحددة لتحقيق تركيزات PTZ المطلوب. لأننا نفضل الجرعة والاستجابة لفحوصات PTZ ، ونحن لوحة كميات مختلفة من لوحات PTZ على 7.5 مل NGM. على سبيل المثال ، يمكن للمرء أن صفيحة 37.5 ميكرولتر من محلول المخزون PTZ على طبق من 7.5 مل NGM لجعل PTZ 5 ملغ / مل حل. السماح لوحات PTZ لتجف لمدة دقيقة تقريبا 60-120 في درجة حرارة الغرفة. ليس من الضروري للقضاء على هذه الأغطية. بدلا من ذلك ، يمكن إضافة PTZ NGM مباشرة ، ولكن ينبغي استخدامه على الفور لفحوصات بعد ترسيخ. استقرار PTZ هو أقل بكثير من الألديكارب. لذلك ، مع لوحات قديمة المقايسات PTZ هي أقل موثوقية. يجب أن يتم تخزينها في PTZ -20 درجة مئوية في مجفف مع وكيل التجفيف قبل استخدامها. نحن نفضل تجاهل PTZ شهرين تقريبا بعد الافتتاح لضمان الاستقرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التجفيف ، لوحة متناسقة من وحدات التخزين E. القولونية (يفضل OP50)على مركز كل لوحة PTZ وجاف لمدة دقيقتين 30-60 في درجة حرارة الغرفة. نحن باستمرار لوحة 25 ميكرولتر من OP50 ، مما يخلق الحشيش الغذاء الحجم بما فيه الكفاية للحفاظ على الديدان تتركز في بقعة صغيرة من دون الاكتظاظ. &nbsp;</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما العشب الغذائية الجافة ، ويمكن للمرء أن المضي قدما في المقايسات PTZ. على الرغم من المقايسات PTZ أقل من المقايسات الألديكارب الذاتية ، فإنه لا يزال ينصح بشدة أن يكون أجرى تجارب &quot;عمياء&quot;. ويمكن لزميل المجرب الأولية إعادة تسمية لوحات أصلية مع الديدان أن يعاير. وبالمثل ، يمكن نقل الزميل الديدان من اللوحات الأصلية لوحات PTZ مشفر مباشرة قبل بدء الموقت. إذا المجرب تتوقع يعاير سلالة معينة من الديدان مع النمط الظاهري مميزة ، مثل uncoordination ، ثم يجب أن يكون هناك أيضا عنصر تحكم مع النمط الظاهري مماثلة للحد من التحيز. وعلاوة على ذلك ، فمن الأفضل إذا المجرب المقايسات سلالة من النوع البري ، فضلا عن التوترات مع تشنجات ، أو كامل الجسم الأمامي ، بالتوازي للمساعدة في توحيد التجارب. يجب أن نسعى جاهدين لالمجرب تحليل عدد ثابت من الديدان لكل تكرار. نحن نحلل على الدوام thirty الديدان من النمط الجيني واحدة لكل تكرار. نقوم ايضا على الاقل ثلاثة مكررات لكل تجربة. يجب على خبرة المجرب يكون قادرا على تحليل ما لا يقل عن ثلاث سلالات في وقت واحد. ومع ذلك ، فإن تواتر وكثافة PTZ بفعل التشنجات الذروة عادة بين 15-30 دقيقة من التعرض ، ومن ثم تخفيف والديدان أصبحت مشلولة ، أو في بعض الحالات ، ويتأقلم مع الدواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد عدد من &quot;الصرع مثل&quot; تشنج الديدان كل 30 دقيقة ليصبح المجموع ساعة واحدة. فمن الأفضل أن يسجل عدد من الديدان مع التشنجات الأمامي ، والذي نطلق عليه اسم &quot;وجها البوب&quot; ، بمعزل عن عدد من الديدان لكامل الجسم مع التشنجات ، وشلل كامل الجسم ، والذي نطلق عليه اسم &quot;منشط&quot; أو مزيج من التشنجات الأمامي مع BWM الشلل الذي نطلق عليه اسم &quot;منشط - الارتجاجية&quot;. معظم الديدان من النمط الجيني واحد يحمل واحد فقط نوع من التشنج. ومع ذلك ، منشط ، رمعي الديدان غالبا ما تصبح منشط تماما ، لذلك ينبغي للمرء أن يواصل مقايسة الماضي 30 دقيقة ، حتى لو كانت جميع الديدان أظهرت بالفعل التشنجات. أيضا ، تجدر الإشارة إلى أن بعض الديدان قد يحاول الزحف بعيدا عن اللوحة. في هذه الحالة ، قد المجرب انتشار كمية الحامض النخيلي ثابت من حول لوحات PTZ. نحن انتشار 25 ميكرولتر من 10 ملغ حمض EtOH / مل بالميتيك. </li></ol> السلوكية ردود مختارة جيم ايليجانس المسوخ نقل متشابك إلى ألديكارب وPTZ <table style="height: 157px;;text-align:right;direction:rtl" border="1"><tbody><tr><th> اسم متحولة </th><th> دور متشابك </th><th> السلوك دون مخدرات </th><th> وردا على ألديكارب السلوكية (مقارنة البرية من نوع N2) </th><th> السلوكية وردا على PTZ </th></tr><tr><td> توم - 1 (ok188) </td><td> يمنع انتقال متشابك </td><td> غير المنسقة </td><td> تعزيز معدل الشلل </td><td> تمييزه عن نوع البرية </td></tr><tr><td> UNC - 43 (n498n1186) </td><td> معقد </td><td> غير المنسقة </td><td> تعزيز معدل الشلل </td><td> كامل الجسم التشنجات </td></tr><tr><td> UNC - 25 (e156) </td><td> يشجع انتقال GABA </td><td> غير المنسقة </td><td> تعزيز معدل الشلل </td><td> الأمامي والتشنجات ، شلل كامل الجسم </td></tr><tr><td> SNB - 1 (md247) </td><td> يشجع انتقال متشابك </td><td> غير المنسقة </td><td> انخفاض معدل الشلل </td><td> التشنجات الأمامي </td></tr><tr><td> UNC - 4 (E120) </td><td> أدن تشافيز يعزز انتقال </td><td> غير المنسقة </td><td> انخفاض معدل الشلل </td><td> تمييزه عن نوع البرية </td></tr></tbody></table> ويمكن استخدام اثنين من المنبهات العصبية ، مثبط أستيل ، ودعا الألديكارب ، ومستقبلات GABA ، ودعا pentylenetetrazole (PTZ) ، بطريقة مكملة لوصف جيم ايليجانس المسوخ انتقال متشابك. أستيل مثير الفائض (ACH) يتراكم في الجسم العصبية والعضلية دودة تقاطعات الحائط (NMJs) من الطفرات المؤذية في المنظمين السلبية للانتقال أدن تشافيز (مثل توم UNC - 1 و 43) أو المنظمين الإيجابية للانتقال المثبطة GABA (على سبيل المثال ، UNC - 25). على العكس ، هي تضاؤل ​​مستويات مثير أدن تشافيز في NMJs الدودة التي الطفرات الضارة في التنظيم الإيجابي للانتقال متشابك العامة (على سبيل المثال ، SNB - 1) أو انتقال الجينات أدن تشافيز محددة (مثل UNC - 4). بالمقارنة مع الديدان N2 من النوع البري ، والديدان متحولة مع ارتفاع مثير انتقال أدن تشافيز في معرض NMJs تعزيز معدلات الألديكارب الشلل الناجم ، في حين خفضت الديدان متحولة مع انتقال أدن تشافيز مثير تثبت انخفاض معدلات الألديكارب التي يسببها الشلل. على الرغم من أن يعطل التزامن PTZ العصبية في عضلات ايليجانس جيم جدار الجسم ، وليس خلافا الألديكارب ، PTZ أيضا يعادى المثبطة GABA في عضلات الرأس ايليجانس جيم. نتيجة لذلك ، يمكن الألديكارب الحساسية لا يمكن التنبؤ بدقة PTZ الحساسية. متحولة الديدان بعيوب محددة في regul سلبية أو إيجابيةأوجه انتقال أدن تشافيز لا يمكن تمييزها عن الديدان N2 من النوع البري في حضور PTZ ، بينما الديدان متحولة مع عيوب في التنظيم الإيجابي للانتقال متشابك عامة أو عيوب معينة في المعرض انتقال المثبطة GABA PTZ قوية بفعل التشنجات الأمامي. وعلاوة على ذلك ، UNC - 43 خسارة وظيفة من المسوخ عرض كامل الجسم التشنجات في حضور PTZ وعلى الأرجح إضافية شذوذ انتقال متشابك ، والتي تسهم في ردودهم المخدرات فريدة من نوعها.

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

البروتوكولات الحالية للتعرض الألديكارب مع جيم ايليجانس المجربون لا تسمح للتمييز بين المسوخ التي تعاني من عجز معين في انتقال أدن تشافيز والمسوخ التي تعاني من عجز معمم في نقل متشابك ، وكلتا الفئتين من المسوخ المعرض مقاومة الألديكارب. وبالمثل ، لا يمكن أن تستخدم لالألديكارب ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Aldicarb</td>
<td>Reagent</td>
<td>Supelco, Inc.</td>
<td>PS734</td>
<td>Purchasable from Sigma</td>
</tr>
<tr>
<td>Pentylenetetrazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

أصبحت الديدان الخيطية ، ايليجانس انواع معينة ، نموذجا مناسبا لدراسة النقل العصبي. جيم ايليجانس هي فريدة من نوعها بين النماذج الحيوانية ، كما تم تحديد التشريح والاتصال لنظامها العصبي من micrographs الإلكترون وصقلها عن طريق فحوصات الدوائية. في هذا الفيديو ، ونحن تصف الكيفية التي يمكن أن تستخدم المنبهات العصبية two التكميلية ، مثبط أستيل ، ودعا الألديكارب ، وحمض الغاما غاما (GABA) مستقبلات ، ودعا pentylenetetrazole (PTZ) ، مما يشير إلى تميز تحديدا في الاعصاب تقاطعات جيم ايليجانس (NMJs) وتيسير فهمنا الدوائر العصبية عدائية. الخلايا العصبية من 302 ايليجانس جيم ، تسعة عشر GABAergic مد عضلات الجسم نوع المحرك يعصب جدار الخلايا العصبية (BWMs) ، في حين أن أربع GABAergic الخلايا العصبية ، ودعا RMEs والعضلات يعصب رأسه. على العكس من ذلك الخلايا العصبية الحركية 39 أعرب عن ناقل عصبي مثير ، أستيل كولين (ACH) ، واستعداء انتقال GABA في BWMs لتنسيق الحركة. في البداية تم تحديد طبيعة عدائية من الخلايا العصبية الحركية وGABAergic كوليني NMJs في جدار الجسم بواسطة الليزر التذرية ، والالتفاف في وقت لاحق بسبب التعرض الألديكارب. نتائج التعرض الحاد الألديكارب في الوقت الشلل بالطبع الجرعة أو استجابة في البرية من نوع الديدان. حتى الآن ، وفقدان انتقال أدن تشافيز مثير يمنح مقاومة الألديكارب ، ويتراكم في أقل أدن تشافيز NMJs الدودة ، مما يؤدي إلى أقل من التحفيز BWMs. ويمكن ملاحظة مقاومة الألديكارب مع أدن تشافيز محددة أو عامة المسوخ وظيفة متشابك. بما يتفق مع GABA العدائية ونقل أدن تشافيز ، وفقدان انتقال GABA ، أو عدم تنظيم سلبا أدن تشافيز الإفراج عنهم ، يمنح فرط الحساسية للالألديكارب. على الرغم من أن التعرض الألديكارب أدى إلى عزلة homologs دودة العديد من الجينات العصبي ، الألديكارب التعرض وحدها لا يمكن تحديد الأدوار بكفاءة السائدة للجينات ومسارات معينة في الخلايا العصبية الحركية ايليجانس جيم. لهذا الغرض ، أدخلنا نهجا تكميلية التجريبي ، والذي يستخدم PTZ. المسوخ العصبي عرض الظواهر واضحة ومتميزة من الشلل الناجم عن الألديكارب ، ردا على PTZ. البرية من نوع الديدان ، وكذلك مع عدم القدرة المسوخ محددة لإطلاق سراحهم أو تلقي أدن تشافيز ، لا تظهر حساسية واضحة لPTZ. ومع ذلك ، المسوخ GABA ، فضلا عن وظيفة عامة المسوخ متشابك ، وعرض التشنجات الأمامي في إطار زمني أو الجرعة بالطبع استجابة. المسوخ التي لا يمكن تنظيم سلبا على الافراج عن العصبي عامة ، وبالتالي تفرز كميات زائدة من أدن تشافيز على BWMs ، أصبحت مشلولة على PTZ. من الظواهر التي يسببها PTZ الطبقات متحولة منفصلة تشير إلى أن اتباع نهج متكامل مع الألديكارب ونماذج التعرض PTZ في ايليجانس جيم قد تعجل فهمنا العصبي. وعلاوة على ذلك ، ينبغي أن يظهر الفيديو كيف نؤدي المقايسات الدوائية تأسيس أساليب متسقة للبحوث ايليجانس جيم.

Watch this Scientific Journal Video about Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants at JoVE.com

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

هذا الفيديو يوضح كيفية توظيف اثنين المنبهات العصبية ، والألديكارب pentylenetetrazole (PTZ) ، بطرق وظيفة مكملة لدراسة متشابك في الخيطية ، C. ايليجانس. ويمكن أيضا أن يكون هذا النهج التكميلية المستخدمة لتسليط الضوء على آليات الحفظ تطويريا لتحوير التزامن العصبية ولها آثار لعلاج الصرع والتشنجات.

نماذج لتوصيف الدوائية من المسوخ جيم ايليجانس نقل متشابك

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

paradigms-for-pharmacological-characterization-c-elegans-synaptic

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  University of Alabama. هذا الفيديو يوضح كيفية توظيف اثنين المنبهات العصبية ، والألديكارب pentylenetetrazole (PTZ) ، بطرق وظيفة مكملة لدراسة متشابك في الخيطية ، C. ايليجانس. ويمكن أيضا أن يكون هذا النهج التكميلية المستخدمة لتسليط الضوء على آليات الحفظ تطويريا لتحوير التزامن العصبية ولها آثار لعل...

Video: Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

فحوصات Neurocircuit عن المضبوطات في المسوخ من الصرع ذبابة الفاكهة</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. ايليجانس الانجذاب الكيميائي الفحص

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

منهج في التثقيف الجنينية<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; خلايا

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

نموذج نقص الأكسجين المجاعة لنقص التروية / ضخه في<em&gt; C. ايليجانس</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

طرق للبشرة إصابة وفحوصات لالردود الجرح في<em&gt; C. ايليجانس</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

طرق لتقييم التحت خلوية من المقصورات في العضلات<em&gt; C. ايليجانس</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...