Мы хотим отметить дух сотрудничества всех членов Колдуэлл Lab. Василий О&#39;Коннор ученый награду от марте Dimes и КАРЬЕРА награду от Национального научного фонда в GAC, а также Бакалавриат Научные исследования грантовой программы из Медицинского института Говарда Хьюза в университете штата Алабама, финансировали нейронную возбудимость и эпилепсии исследований в Лаборатории Колдуэлл.

Альдикарб выдержки Paradigm <ol><li> В первый день, чтобы по крайней мере тридцати молодых взрослой стадии червей каждого генотипа и каждой репликации будут доступны для альдикарб пробы на второй день. Лучше всего, если экспериментатор выбирает пятьдесят и более L4 червей стадии в свежем пластин NGM (лучше без нистатин), которые содержат Е. палочка (желательно OP50) в качестве источника пищи, и выращивают их в течение 12-24 часов при последовательной и разрешительной температуре (20 ° С до 22 ° C лучше, хотя 25 ° C в порядке). </li><li> На второй день, сделайте 100 мМ исходный раствор альдикарб с 70% этанола (этанол) и 30% DDH 2 O. Распространение соответствующее количество альдикарб на NGM минус нистатин пластин с определенными объемами для достижения желаемого концентрации альдикарб. Мы последовательно использовать 0,5 мМ альдикарб при посеве 37,5 мкл 100 мМ альдикарб на 7,5 мл NGM пластин. Разрешить альдикарб пластин высохнуть в течение примерно 30-60 минут при комнатной температуре. Это не обязательно, чтобы взломать крышками. Кроме того, альдикарб могут быть добавлены к НГО и хранили при 4 ° С в течение одной недели. &nbsp;</li><li> После сушки пластины соответствуют объемам Е. палочка (желательно OP50) на центре каждой пластины альдикарб и сухой в течение еще ​​30-60 минут при комнатной температуре. Мы последовательно пластины 25 мкл OP50, что создает достаточный размер пищи газон держать червей сконцентрированы в небольшом месте без переполненности тюрем. &nbsp;</li><li> Когда пища газона сухая, можно приступить альдикарб анализов. Из-за субъективного характера анализы алдикарб, настоятельно рекомендуется, что эксперименты проводить &quot;вслепую&quot;. Коллега первичной экспериментатор может повторно маркировать оригинальных пластин с червями, чтобы быть проанализированы. Кроме того, коллеги могли передать червей от первоначального пластины зашифрованные пластин альдикарб непосредственно перед началом таймера. Если экспериментатор предполагает опробование конкретного штамма червей с характерным фенотипом, таких как uncoordination, то должно быть управление с аналогичными фенотип уменьшения систематической ошибки. Кроме того, это лучше, если экспериментатор анализов штамма дикого типа, а также устойчивый штамм и сверхчувствительным напряжения, параллельно, чтобы помочь стандартизировать экспериментов. Экспериментатор должен стремиться, чтобы проанализировать соответствует количество червей для каждой репликации. Мы постоянно анализируем тридцать червей одного генотипа для каждой репликации. Мы также осуществляем по крайней мере три повторяет для каждого эксперимента. Опытный экспериментатор должен иметь возможность анализировать не менее шести штаммов одновременно. &nbsp;</li><li> Подсчитайте количество парализована червей подталкивая в согласованном порядке каждого червя с платиновой проволоки. Мы последовательно подтолкнуть наших червей в два раза по голове и два раза на хвост каждые 30 минут в общей сложности три часа. Прекращение глотки насосные также может быть использован для определения паралич, но только если экспериментатор использует последовательное определение паралич на все анализы. Кроме того, стоит отметить, что некоторые черви, особенно те, которые устойчивы к алдикарб, может попытаться ползти от пластины. В этом случае экспериментатор может распространиться последовательной количество пальмитиновая кислота, физический барьер для передвижения червей, около альдикарб пластин. Выкладываем 25 мкл 10 мг пальмитиновая кислота / мл этанола. </li></ol> PTZ выдержки Paradigm <ol><li> В первый день, чтобы по крайней мере тридцати молодых взрослой стадии червей каждого генотипа и каждого повторить будет доступен для тестов PTZ на второй день. Лучше всего, если экспериментатор выбирает пятьдесят и более L4 червей стадии в свежем пластин NGM (лучше без нистатин), которые содержат Е. палочка (желательно OP50) в качестве источника пищи, и выращивают их в течение 12-24 часов при последовательной и разрешительной температуре (20 ° С до 22 ° C лучше, хотя 25 ° C в порядке). </li><li> На второй день, сделайте 0,5 г PTZ / мл DDH 2 O исходного раствора PTZ. Распространение соответствующее количество PTZ на NGM минус нистатин пластин с определенными объемами для достижения желаемого концентрации PTZ. Потому что мы предпочитаем доза-реакция анализы для PTZ, мы пластины различного количества PTZ на 7,5 мл NGM пластин. Например, можно пластины 37,5 мкл исходного раствора PTZ на 7,5 пластины NGM мл, чтобы сделать 5 мг PTZ / мл раствора. Разрешить PTZ пластин высохнуть в течение примерно 60-120 минут при комнатной температуре. Это не обязательно, чтобы взломать крышками. Кроме того, PTZ могут быть добавлены непосредственно в НГО, но она должна быть немедленно использованы для анализов после затвердевания. Стабильность PTZ значительно меньше, чем у альдикарб. Таким образом, тесты со взрослыми пластин PTZ являются менее надежными. PTZ следует хранить при температуре -20 ° С в сушильном шкафу с сушильного агента перед использованием. Мы предпочитаем отказаться от PTZ примерно через два месяца после открытия, чтобы обеспечить стабильность. </li><li> После сушки пластины соответствуют объемам Е. палочка (желательно OP50)на центре каждой пластины PTZ и сухой в течение еще 30-60 минут при комнатной температуре. Мы последовательно пластины 25 мкл OP50, что создает достаточный размер пищи газон держать червей сконцентрированы в небольшом месте без переполненности тюрем. &nbsp;</li><li> Когда пища газона сухая, можно продолжить анализы PTZ. Хотя PTZ анализы менее субъективным, чем анализы алдикарб, он по-прежнему настоятельно рекомендуется проводить эксперименты «вслепую». Коллега первичной экспериментатор может повторно маркировать оригинальных пластин с червями, чтобы быть проанализированы. Кроме того, коллеги могли передать червей от первоначального пластины зашифрованные пластин PTZ непосредственно перед началом таймера. Если экспериментатор предполагает опробование конкретного штамма червей с характерным фенотипом, таких как uncoordination, то должно быть управление с аналогичными фенотип уменьшения систематической ошибки. Кроме того, это лучше, если экспериментатор анализов штамма дикого типа, а также штаммов с передним или полным тело конвульсии, параллельно, чтобы помочь стандартизировать экспериментов. Экспериментатор должен стремиться, чтобы проанализировать соответствует количество червей для каждой репликации. Мы постоянно анализируем тридцать червей одного генотипа для каждой репликации. Мы также осуществляем по крайней мере три повторяет для каждого эксперимента. Опытный экспериментатор должен иметь возможность анализировать не менее трех штаммов одновременно. Тем не менее, частота и интенсивность PTZ-индуцированные судороги обычно пик 15-30 минут воздействия, а затем затухают, как черви стали парализованными или, в некоторых случаях, акклиматизироваться к препарату. </li><li> Посчитайте количество &quot;эпилептического типа&quot; конвульсиях червей каждые 30 минут в общей сложности один час. Лучше всего, чтобы оценка количества червей с передней судороги, которые мы называем &quot;голова качается&quot;, отдельно от количества червей с полным тело конвульсии, полный паралич тела, которую мы называем &quot;тоник&quot;, или сочетание передняя судороги с BWM паралич, который мы называем &quot;тонико-клонические&quot;. Большинство червей одного генотипа проявляют лишь один вид судорог. Тем не менее, тонико-клонические черви зачастую становятся полностью тоник, поэтому следует продолжать анализ последних 30 минут, даже если все черви уже выставлены судороги. Кроме того, стоит отметить, что некоторые черви могут попытаться ползти от пластины. В этом случае экспериментатор может распространиться последовательной количество пальмитиновая кислота вокруг пластин PTZ. Выкладываем 25 мкл 10 мг пальмитиновая кислота / мл этанола. </li></ol> Поведенческие реакции Выбранный C. Элеганс Synaptic Мутанты передачи в альдикарб и PTZ <table style="height: 157px;" border="1"><tbody><tr><th> Мутант Имя </th><th> Роль Synaptic </th><th> Поведение без наркотиков </th><th> Поведенческий ответ на альдикарб (по сравнению с диким типом N2) </th><th> Поведенческий ответ на PTZ </th></tr><tr><td> Том-1 (ok188) </td><td> тормозит синаптическую передачу </td><td> несогласованный </td><td> увеличенной скоростью паралича </td><td> неотличимы от дикого типа </td></tr><tr><td> UNC-43 (n498n1186) </td><td> комплекс </td><td> несогласованный </td><td> увеличенной скоростью паралича </td><td> все тело конвульсии </td></tr><tr><td> UNC-25 (e156) </td><td> ГАМК способствует передаче </td><td> несогласованный </td><td> увеличенной скоростью паралича </td><td> передняя судороги, все тело паралич </td></tr><tr><td> СНБ-1 (md247) </td><td> способствует синаптической передачи </td><td> несогласованный </td><td> сниженной ставке паралич </td><td> передняя судороги </td></tr><tr><td> UNC-4 (E120) </td><td> способствует передаче АЧ </td><td> несогласованный </td><td> сниженной ставке паралич </td><td> неотличимы от дикого типа </td></tr></tbody></table> Два нейронных стимуляторов, ингибиторов ацетилхолинэстеразы, называемый алдикарб, и антагонист рецепторов ГАМК, называемый pentylenetetrazole (PTZ), могут быть использованы на основе взаимодополняемости, чтобы охарактеризовать C. Элеганс синаптической передачи мутантов. Превышение возбуждающие ацетилхолина (АХ) накапливается в теле червя стену нервно-мышечного соединения (NMJs) от вредных мутаций в негативных регуляторов АЧ передачи (например, том-1 и UNC-43) или положительный регуляторы тормозных ГАМК-передачи (например, UNC-25). С другой стороны, возбуждающие уровни ацетилхолина на червя NMJs уменьшаются на вредных мутаций в положительной регуляторы общей синаптической передачи (например, SNB-1) или АЧ-специфических генов передачи (например, UNC-4). По сравнению с диким типом червей N2, червей мутантов с повышенной передачи возбуждающих АЧ на NMJs обладают повышенной скорости альдикарб вызванного параличом, в то время как черви мутанта с пониженной передаче возбуждающих АЧ демонстрируют снижение темпов альдикарб вызванного параличом. Хотя PTZ нарушает нейронные синхронность в Элеганс C. мышцах стенки тела, а не в отличие от алдикарб, PTZ также противодействует тормозных ГАМК в мышцах C. Элеганс голову. В результате, альдикарб чувствительность не может точно предсказать PTZ чувствительности. Мутант червей с конкретными дефектами в отрицательной или положительной RegulЭйшен передачи АЧ неотличимы от дикого типа N2 червей в присутствии PTZ, в то время как мутант червей с дефектами в положительной регуляции общего синаптической передачи или конкретных дефектов в тормозной ГАМК выставку передачи надежной PTZ-индуцированной передней судороги. Более того, UNC-43 с потерей функции мутантов отображения всего тела судороги в присутствии PTZ и, вероятно, имеют дополнительные нарушения синаптической передачи, которые способствуют их уникальных ответов препарата.

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

Действующие протоколы по альдикарб экспозиции с C. Элеганс не позволяют экспериментаторам различать мутанты с конкретными дефицита ацетилхолина передачи и мутанты с обобщенными дефицит в синаптической передаче, так как оба класса мутантов выставку сопротивление альдикарб. Кроме того, алди...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Aldicarb</td>
<td>Reagent</td>
<td>Supelco, Inc.</td>
<td>PS734</td>
<td>Purchasable from Sigma</td>
</tr>
<tr>
<td>Pentylenetetrazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

Watch this Scientific Journal Video about Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants at JoVE.com

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

В этом видеоролике показано, как использовать два нервных стимуляторов, альдикарб и pentylenetetrazole (PTZ), в дополнительных способов изучения синаптической функции в нематода C. Элеганс. Этот дополнительный подход может также использоваться, чтобы пролить свет на эволюционно консервативных механизмов для модуляции нейронной синхронии и имеет значение для лечения эпилепсии и эпилептические припадки.

Парадигмы для Фармакологические Характеристика C. Элеганс Synaptic Мутанты передачи

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

paradigms-for-pharmacological-characterization-c-elegans-synaptic

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  University of Alabama. В этом видеоролике показано, как использовать два нервных стимуляторов, альдикарб и pentylenetetrazole (PTZ), в дополнительных способов изучения синаптической функции в нематода C. Элеганс. Этот дополнительный подход может также использоваться, чтобы пролить свет на эв?...

Video: Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit Анализы для изъятий в Эпилепсия Мутанты Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. Элеганс Анализ хемотаксиса

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Метод для культивирования эмбриональных<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Клетки

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Аноксия-голодание модель ишемии / реперфузии в<em&gt; С. Элеганс</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Методы для кожи телесные повреждения и анализы для заживления ответы в<em&gt; C. Элеганс</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Методы оценки субклеточных отсеков Muscle в<em&gt; С. Элеганс</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...