Biz tüm Caldwell Lab üyeleri işbirliği ruhu kabul etmek istiyoruz. Dimes, Mart ve Ulusal Bilim Vakfı GAC KARİYER Ödülü Basil O&#39;Connor Scholar Ödülü yanı sıra, Alabama Üniversitesi ile Howard Hughes Tıp Enstitüsü Lisans Araştırma Lisans Programı Hibe, nöronal uyarılabilirliği ve finanse Caldwell Lab epilepsi araştırma.

Aldicarb Pozlama paradigması <ol><li> İlk gün, her genotip ve her çoğaltmak en az otuz genç yetişkin aşamada solucanlar aldicarb testlerin ikinci gününde kullanılabilir olmasını sağlamak. E. içeren taze NGM plakalar üzerine elli veya daha fazla L4 aşamada solucanlar (en iyi nystatin olmadan), bir deneyci seçerse en iyisidir bir besin kaynağı olarak coli (tercihen OP50), tutarlı ve müsamahakar sıcaklığında (20 ° C - 22 ° C 25 ° C tamam olmasına rağmen, en iyi), 12-24 saat boyunca onları büyümeye </li><li> Ikinci gününde,% 70 etanol (EtOH) ve% 30 GKD 2 O. aldicarb 100 mM stok solüsyonu Istenen aldicarb konsantrasyonları elde etmek için uygun miktarda aldicarb tanımlanan hacimli NGM eksi nistatin plakalar üzerine sürün. Biz sürekli olarak 7.5 ml NGM plakalar üzerine kaplama ile 100 mM aldicarb 37.5 mcL 0.5 mM aldicarb kullanabilirsiniz. Aldicarb plakaları oda sıcaklığında yaklaşık 30-60 dakika kurumasını bekleyin. Bu kapaklar çatlak için gerekli değildir. Alternatif olarak, aldicarb NGM eklendi ve 4 ° C de bir hafta boyunca saklanan olabilir. &nbsp;</li><li> E. kurutma, plaka tutarlı hacimleri sonra Her aldicarb plaka merkezi ve başka bir 30-60 dakika oda sıcaklığında kuru üzerine coli (tercihen OP50). Biz sürekli aşırı kalabalık olmayan, küçük bir noktada yoğunlaşmış solucanlar tutmak için yeterli büyüklükte bir gıda çim oluşturur plaka OP50 25 mcL. &nbsp;</li><li> Gıda çim kuru olduğunda, bir aldicarb deneyleri ile devam edebilir. Aldicarb deneyleri öznel doğası nedeniyle, son derece deneyleri &quot;körü körüne&quot; yapılması tavsiye edilir. Birincil deneyci bir meslektaşım çalışılmalıdır solucanlar orijinal plakaları yeniden-etiket. Aynı şekilde, iş arkadaşı, bir zamanlayıcı başlamadan hemen önce, orijinal plakalardan şifreli aldicarb plakaları solucanlar transfer olabilir. Deneyci solucanlar gibi uncoordination gibi karakteristik bir fenotip, belirli bir gerginlik assaying öngörüyor, sonra da orada yanlılığı azaltmak için benzer bir fenotip bir kontrol edilmelidir. Dahası, deneyci deneyleri deneyler standardize yardımcı paralel yabani tip bir gerginlik yanı sıra dirençli ve aşırı duyarlı bir gerginlik, eğer en iyisidir. Deneyci solucanlar her çoğaltmak için tutarlı bir analiz etmek için gayret göstermelisiniz. Biz sürekli olarak her çoğaltmak için tek bir genotip otuz solucanlar analiz eder. Biz de en az üç gerçekleştirin her bir deney için çoğaltır. Deneyimli bir deneyci bir defada en az altı suşları analiz etmek gerekir. &nbsp;</li><li> Tutarlı bir şekilde dürtüsüyle bir platin tel ile her solucan felç solucanlar sayısını. Biz iki kez baş ve kuyruk üç saat olmak üzere toplam her 30 dakikada iki kez sürekli solucanlar eşya. Faringeal pompalama durması da deneyci, tüm çalışmalar boyunca felç tutarlı bir tanım istihdam sadece felç tanımlamak için kullanılır, ama olabilir. Ayrıca, özellikle bazı solucanlar, aldicarb karşı dayanıklı bu plaka tarama deneyebilir fazlalaştı. Bu durumda, deneyci aldicarb plakaların etrafında, palmitik asit, solucan lokomosyon fiziksel bir bariyer tutarlı bir miktarda yayılabilir. Biz 10 mg palmitik asit / ml EtOH 25 mcL yayıldı. </li></ol> PTZ Pozlama Paradigma <ol><li> İlk gün, her genotip ve her çoğaltmak en az otuz genç yetişkin aşamada solucanlar ikinci gününde PTZ testleri için kullanılabilir olmasını sağlamak. E. içeren taze NGM plakalar üzerine elli veya daha fazla L4 aşamada solucanlar (en iyi nystatin olmadan), bir deneyci seçerse en iyisidir bir besin kaynağı olarak coli (tercihen OP50), tutarlı ve müsamahakar sıcaklığında (20 ° C - 22 ° C 25 ° C tamam olmasına rağmen, en iyi), 12-24 saat boyunca onları büyümeye </li><li> Ikinci gününde, PTZ 0.5 g PTZ / ml GKD 2 O stok solüsyonu olun. PTZ uygun miktarda, istenilen PTZ konsantrasyonları elde etmek için tanımlanmış hacimli NGM eksi nistatin plakalar üzerine sürün. PTZ için doz-yanıt deneyleri tercih Çünkü plaka 7.5 mL NGM plakalar üzerine PTZ değişen miktarlarda. Örneğin, bir plaka PTZ stok solüsyonu 7.5 ml NGM tabağa mcL 37.5, 5 mg PTZ / ml çözüm haline getirmektedir. PTZ plakaları oda sıcaklığında yaklaşık 60-120 dakika kurumasını bekleyin. Bu kapaklar çatlak için gerekli değildir. Alternatif olarak, PTZ NGM direkt olarak ilave edilebilir, ancak hemen katılaşmadan sonra deneyleri için kullanılmalıdır. PTZ istikrarı aldicarb bu çok daha az. Bu nedenle, eski PTZ plakaları ile testlerin daha az güvenilir. PTZ kullanmadan önce kurutucu bir desikatöre -20 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir. Biz istikrarı sağlamak için açtıktan sonra yaklaşık iki ay PTZ atmak için tercih ediyor. </li><li> E. kurutma, plaka tutarlı hacimleri sonra coli (tercihen OP50)Her PTZ plaka ve başka bir 30-60 dakika oda sıcaklığında kuru merkezi üzerine. Biz sürekli aşırı kalabalık olmayan, küçük bir noktada yoğunlaşmış solucanlar tutmak için yeterli büyüklükte bir gıda çim oluşturur plaka OP50 25 mcL. &nbsp;</li><li> Gıda çim kuru olduğunda, bir PTZ testleri devam edebilir. PTZ testleri aldicarb testleri daha az öznel olmakla birlikte, hala çok deneyleri &quot;körü körüne&quot; yapılması tavsiye edilir. Birincil deneyci bir meslektaşım çalışılmalıdır solucanlar orijinal plakaları yeniden-etiket. Aynı şekilde, iş arkadaşı, bir zamanlayıcı başlamadan hemen önce orijinal plakalardan şifrelenmiştir PTZ plakaları solucanlar transfer olabilir. Deneyci solucanlar gibi uncoordination gibi karakteristik bir fenotip, belirli bir gerginlik assaying öngörüyor, sonra da orada yanlılığı azaltmak için benzer bir fenotip bir kontrol edilmelidir. Ayrıca, deneyci deneyleri deneyler standardize yardımcı paralel ön veya tam vücut konvülsiyonlar ile yabani tip gerginlik yanı sıra suşları, eğer iyi olur. Deneyci solucanlar her çoğaltmak için tutarlı bir analiz etmek için gayret göstermelisiniz. Biz sürekli olarak her çoğaltmak için tek bir genotip otuz solucanlar analiz eder. Biz de en az üç gerçekleştirin her bir deney için çoğaltır. Deneyimli bir deneyci bir defada en az üç tür analiz etmek gerekir. Ancak, solucanlar ilaç gelmesini felç olmak veya bazı durumlarda, PTZ ile indüklenen maruz kalma 15-30 dakika arasında genellikle tepe konvülsiyonlar ve sıklığını ve şiddetini zayıflatmak. </li><li> Toplam bir saatlik bir &quot;sara gibi&quot; solucanlar çırpınan her 30 dakika sayısını. Solucanlar sayısı tam vücut konvülsiyonlar, tam vücut felç, &quot;tonik&quot; diyoruz, ya da bir kombinasyonu ile ayrı ayrı &quot;kafa kafaya bobs&quot; diyoruz ön konvülsiyonlar, solucanlar sayısını skor iyi , &quot;tonik-klonik&quot; diyoruz BWM felç anterior konvülsiyonlar,. Çoğu tek bir genotip solucanlar konvülsiyon sadece bir tür sergiler. Ancak, tonik-klonik solucanlar genellikle tamamen tonik, bu yüzden tüm solucanlar zaten konvülsiyonlar sergilenmektedir olsa bile bir 30 dakika geçmiş tahlil devam etmelidir. Ayrıca, bazı solucanlar plaka tarama deneyebilir fazlalaştı. Bu durumda, deneyci tutarlı bir PTZ plakaların etrafında palmitik asit miktarı yayılabilir. Biz 10 mg palmitik asit / ml EtOH 25 mcL yayıldı. </li></ol> Aldicarb ve PTZ Seçilmiş C. elegans Sinaptik İletim Mutants Davranış Yanıtları <table style="height: 157px;" border="1"><tbody><tr><th> Mutant Adı </th><th> Synaptic Rolü </th><th> İlaç olmayan davranışı </th><th> Aldicarb Davranış Tepki (yabani tip N2 göre) </th><th> PTZ için Davranışsal Tepki </th></tr><tr><td> tom-1 (ok188) </td><td> sinaptik iletim inhibe </td><td> koordinasyonsuz </td><td> gelişmiş felç oranı </td><td> wild-tip ayırt edilemez </td></tr><tr><td> unc-43 (n498n1186) </td><td> karmaşık </td><td> koordinasyonsuz </td><td> gelişmiş felç oranı </td><td> tam vücut konvülsiyonlar </td></tr><tr><td> unc-25 (e156) </td><td> GABA iletim teşvik </td><td> koordinasyonsuz </td><td> gelişmiş felç oranı </td><td> ön konvülsiyonlar, tam vücut felci </td></tr><tr><td> SNB-1 (md247) </td><td> sinaptik iletim teşvik </td><td> koordinasyonsuz </td><td> felç düşük oranda </td><td> ön konvülsiyonlar </td></tr><tr><td> unc-4 (E120) </td><td> ACh iletim teşvik </td><td> koordinasyonsuz </td><td> felç düşük oranda </td><td> wild-tip ayırt edilemez </td></tr></tbody></table> Pentylenetetrazole (PTZ) olarak adlandırılan iki sinir uyarıcı aldicarb denilen bir asetilkolinesteraz inhibitörü ve GABA reseptör antagonisti, C. elegans sinaptik iletim mutantlar karakterize etmek için tamamlayıcı bir şekilde kullanılabilir. Aşırı eksitatör asetilkolin (Ach) solucan vücut duvarı nöromüsküler kavşaklar (NMJs) ACh iletim negatif düzenleyiciler zararlı mutasyonlar birikir (mesela tom-1 ve unc-43) veya inhibitör GABA şanzıman (örneğin, amc-25) pozitif düzenleyiciler. Tersine, solucan NMJs eksitatör ACh düzeyleri, zararlı mutasyonların genel sinaptik iletim (örneğin, SNB-1) veya ACh özel iletim genler (örneğin unc-4) pozitif düzenleyiciler azaldı. Alçaltılmış eksitatör ACh iletim mutant solucanlar aldicarb kaynaklı felç azalmış oranları göstermektedir ise yabani tip N2 solucanlar karşılaştırıldığında, NMJs yükseltilmiş eksitatör ACh şanzıman ile mutant solucanlar, aldicarb kaynaklı felç gelişmiş oranları sergilerler. PTZ, C. elegans vücut duvarı kasları aldicarb aksine nöronal senkronizasyonunu bozan rağmen, PTZ C. elegans baş kasları da inhibitör GABA antagonize. Sonuç olarak, aldicarb hassasiyet, PTZ hassasiyetini doğru tahmin edemez. Negatif ya da pozitif Regul özel kusurları olan Mutant solucanlarACh iletim ation PTZ varlığı yabani tip N2 solucanlar ayırt edilemez, inhibitör GABA iletim sergi sağlam PTZ ile indüklenen ön konvülsiyonlar genel sinaptik iletim ya da belirli kusurlar olumlu yönetmelikte kusurları ile mutant solucanlar ise. Ayrıca, PTZ varlığı unc-43-fonksiyon kaybı mutantlar tam vücut konvülsiyonlar görüntüler ve muhtemelen kendilerine özgü ilaç yanıtları katkıda bulunan ek sinaptik iletim anormallikleri var.

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

C ile aldicarb maruziyet için mevcut protokoller elegans mutantlar iki sınıfları aldicarb direnç gösterirler deneyciler, sinaptik iletim genelleştirilmiş açıkları ile ACh iletim ve mutantlar belirli eksiklikler ile mutantlar arasında ayrım izin vermez. Aynı şekilde, aldicarb mutantlar iki sınıfları aldicarb aşırı duyarlılık sergileyen mutantlar olumsuz ACh iletim düzenleyen GABA iletim veya genelleştirilmiş hataları belirli eksiklikler varsa belirlemek için kullanılan olamaz. PTZ maruz deneyler...

<table><tbody><tr><td>Aldicarb</td><td>Reagent</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>PS734</td><td>Purchasable from Sigma</td></tr><tr><td>Pentylenetetrazole</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td></td></tr></tbody></table>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

Caenorhabditis elegans, nematod, nörotransmisyon çalışmak için bir çare bir model haline gelmiştir. Sinir sistemi anatomisi ve bağlantı elektron mikrograflar belirlenir ve farmakolojik testlerin rafine olarak C. elegans, hayvan modelleri arasında eşsizdir. Bu video, özellikle C. elegans nöromüsküler kavşaklarda sinyalizasyon karakterize pentylenetetrazole (PTZ) olarak adlandırılan iki tamamlayıcı sinir uyarıcı, aldicarb denilen bir asetilkolinesteraz inhibitörü ve bir gama-amino butirik asit (GABA) reseptör antagonisti, istihdam nasıl tarif (NMJs) ve antagonist nöral devrelerin anlaşılmasını kolaylaştırmak. 302 C. elegans nöronlar, ondokuz GABAerjik D-tipi motor nöronlar innerve vücut duvarı kasları (BWMs), Of iken RMEs adlı dört GABAerjik nöronlar, innerve baş kasları. Tersine, otuz dokuz motor nöronların asetilkolin eksitatör nörotransmitter ifade (ACh) ve GABA iletim lokomosyon koordine etmek BWMs antagonize. Vücut duvarı NMJs GABAerjik ve kolinerjik motor nöronların antagonistik doğa başlangıçta lazer ablasyon tarafından belirlenir ve daha sonra aldicarb maruz tarafından desteklenebilir. Yabani tip solucanlar bir zaman kurs veya doz-yanıt felç Akut aldicarb pozlama sonuçları. Ancak, daha az ACh, solucan NMJs birikir gibi eksitatör ACh iletim kaybı, BWMs az stimülasyonuna yol, aldicarb direnç bahşeder. ACh özel veya genel sinaptik fonksiyon mutantlar aldicarb için direnç görülebilir. GABA antagonistik ve ACh şanzıman, GABA iletim kaybı ya da olumsuz ACh serbest düzenlemek için bir başarısızlık ile tutarlı, aldicarb aşırı duyarlılık bahşeder. Aldicarb maruz aldicarb maruz kalma, çok sayıda solucan homologları nörotransmisyon genlerin izolasyonu yol olmasına rağmen, tek başına verimli özel C. elegans motor nöronların genler ve yollar için geçerli olan rolleri tespit edemez. Bu amaçla, tamamlayıcı bir deneysel yaklaşım, PTZ kullanır girmiştik. Nörotransmisyon mutantlar PTZ yanıt aldicarb-kaynaklı felç farklı açık fenotipleri, gösterir. Wild-tip solucanların yanı sıra, ACh salınımı veya almak için özel Yetersizliklerimizle ile mutantlar, PTZ için belirgin hassasiyet görünmüyor. Bununla birlikte, GABA mutantlar yanı sıra genel sinaptik fonksiyon mutant zaman kurs veya doz duyarlı bir şekilde ön konvülsiyonlar. Genel nörotransmitter serbest olumsuz düzenleyen ve böylece, Mutants PTZ üzerinde felç haline BWMs üzerine ACh aşırı miktarda salgılar. Ayrık mutant sınıfların PTZ ile indüklenen fenotipleri C. elegans aldicarb ve PTZ maruz paradigmalar ile tamamlayıcı bir yaklaşım nörotransmisyon anlayışımız hızlandırmak olduğunu göstermektedir. Ayrıca, biz farmakolojik testlerin nasıl performans gösteren videolar C. elegans araştırma için tutarlı yöntemler oluşturmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants at JoVE.com

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Bu video iki sinir uyarıcı, aldicarb ve pentylenetetrazole (PTZ), nematod, C. elegans sinaptik fonksiyonu çalışma tamamlayıcı yollardan nasıl istihdam göstermektedir. Bu modüle nöronal senkronizasyonu için evrimsel olarak korunmuş mekanizmaları tamamlayıcı bir yaklaşım da ışık tutmak için kullanılan ve epilepsi ve nöbet etkileri olabilir.

C. elegans Sinaptik İletim Mutants farmakolojik karakterizasyonu için Paradigmalar

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

paradigms-for-pharmacological-characterization-c-elegans-synaptic

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Görüntüleme.  University of Alabama. Bu video iki sinir uyarıcı, aldicarb ve pentylenetetrazole (PTZ), nematod, C. elegans sinaptik fonksiyonu çalışma tamamlayıcı yollardan nasıl istihdam göstermektedir. Bu modüle nöronal senkronizasyonu için evrimsel olarak korunmuş mekanizmaları tamamlayıcı bir yaklaşım da ışık tutmak için kullanılan ve epilepsi ve nöbet etkileri olabilir.

Video: Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Nematod Popülasyona Dayalı Kemoterapi Tercihi Testinin Otomatik Analizi

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Davranış

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Nörobilim

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Biyoloji

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) controls several functions in C. elegans including learning and motor activity. Conditions that stimulate DA release (e.g., amphetamine (AMPH) treatments) or that prevent DA clearance (e.g., animals lacking the DA transporter (dat-1) which are incapable of reaccumulating DA into the neurons) generate an excess of extracellular DA ultimately resulting in inhibited locomotion. This behavior is particularly evident when animals swim in water. In fact, while wild-type animals continue to swim for an extended period, dat-1 null mutants and wild-type treated with AMPH or inhibitors of the DA transporter sink to the bottom of the well and do not move. This behavior is termed "Swimming Induced Paralysis" (SWIP). Although the SWIP assay is well established, a detailed description of the method is lacking. Here, we describe a step-by-step guide to perform SWIP. To perform the assay, late larval stage-4 animals are placed in a glass spot plate containing control sucrose solution with or without AMPH. Animals are scored for their swimming behavior either manually by visualization under a stereoscope or automatically by recording with a camera mounted on the stereoscope. Videos are then analyzed using a tracking software, which yields a visual representation of thrashing frequency and paralysis in the form of heat maps. Both the manual and automated systems guarantee an easily quantifiable readout of the animals' swimming ability and thus facilitate screening for animals bearing mutations within the dopaminergic system or for auxiliary genes. In addition, SWIP can be used to elucidate the mechanism of action of drugs of abuse such as AMPH.

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming induced paralysis (SWIP) is a well-established behavioral assay used to study the underlying mechanisms of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans (C. elegans). However, a detailed method to perform the assay is lacking. Here, we describe a step-by-step protocol for SWIP.

Yüzme felç indüklenen Caenorhabditis elegans dopamin sinyal değerlendirmek için

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle contraction. As in vertebrate skeletal muscle, cholinergic signaling in the body wall muscles of the model organism Caenorhabditis elegans is required for locomotion. Exposure to levamisole, a pharmacological agonist of one class of ACh receptors on the body wall muscles, causes time-dependent paralysis of wild-type animals. Altered sensitivity to levamisole suggests defects in signaling at the NMJ or muscle function. Here, a protocol for a liquid levamisole assay performed on C. elegans grown in 24-well plates is presented. Vigorous swimming of the animals in liquid allows for the assessment and quantitation of levamisole-induced paralysis in hundreds of worms over a one-hour time period without requiring physical manipulation. This procedure can be used with both wild-type and mutants that have altered sensitivity to levamisole to demonstrate the functional consequences of altered signaling at the NMJ.

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

The present protocol describes an assay to determine response to levamisole, a pharmacological agonist of one class of Caenorhabditis elegans acetylcholine receptors. In this liquid levamisole swim assay, researchers visually observe and quantitate the time-dependent paralysis of animals cultivated in 24-well plates.

Caenorhabditis elegans Ölçümü Asetilkolin Reseptör Agonisti Levamisol'a duyarlılık

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Genetik

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Antipsikotik İlaçların Etki Mekanizmaları incelenmesi için Yöntemleri<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1</emOtizm> olarak Adaylar

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

Büyük ölçekli Gen demonte olarak<em&gt; C. elegans</em&gt; Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

C. elegans Sinaptik İletim Mutants farmakolojik karakterizasyonu için Paradigmalar

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nematod Popülasyona Dayalı Kemoterapi Tercihi Testinin Otomatik Analizi

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Yüzme felç indüklenen Caenorhabditis elegans dopamin sinyal değerlendirmek için

Caenorhabditis elegans Ölçümü Asetilkolin Reseptör Agonisti Levamisol'a duyarlılık

Antipsikotik İlaçların Etki Mekanizmaları incelenmesi için Yöntemleri

Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1 olarak Adaylar

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Büyük ölçekli Gen demonte olarak