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Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

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The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Georgia Institute of Technology

&#x767D;&#x4E09;&#x70EF; &#xFF08;LT&#xFF09; C(4) &#x5408;&#x6210;&#x9176;&#x3001; 18 kDa &#x79EF;&#x5206;&#x819C;&#x9176;&#x5171;&#x8F6D; LTA(4) &#x4E0E;&#x51CF;&#x5C11;&#x8C37;&#x80F1;&#x7518;&#x80BD;&#x5BF9;&#x8868;&#x5355; LTC(4)&#xFF0C;&#x7236;&#x590D;&#x5408;&#x7684;&#x6240;&#x6709;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9170;&#x767D;&#x4E09;&#x70EF;&#x5728;&#x652F;&#x6C14;&#x7BA1;&#x54EE;&#x5598;&#x7684;&#x75C5;&#x7406;&#x65B9;&#x9762;&#x53D1;&#x6325;&#x7740;&#x81F3;&#x5173;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x6839;&#x636E;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x8BA1;&#x7B97;&#xFF0C;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x4E3A; 4.5 A &#x91CD;&#x7EC4;&#x4EBA;&#x7C7B; LTC(4) &#x5408;&#x9176;&#x6295;&#x5F71;&#x5730;&#x56FE;&#x7531;&#x7535;&#x5B50;&#x6676;&#x4F53;&#x5B66;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x79CD;&#x9176;&#x662F;&#x4E09;&#x805A;&#x4F53;&#x3002;&#x5728; 7.5 A &#x5904;&#x622A;&#x65AD;&#x5730;&#x56FE;&#x76F4;&#x89C2;&#x663E;&#x793A;&#x56DB;&#x4E2A;&#x8DE8;&#x819C; &alpha; &#x87BA;&#x65CB;&#x86CB;&#x767D;&#x5355;&#x4F53;&#x6BCF;&#x3002;&#x5728;&#x6295;&#x5F71;&#x4E2D;&#x7684;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x6307;&#x793A;&#x7684;&#x963F;&#x5C14;&#x6CD5;&#x87BA;&#x65CB;&#x5927;&#x591A;&#x6570;&#x8FD0;&#x884C;&#x51E0;&#x4E4E;&#x5782;&#x76F4;&#x4E8E;&#x5E73;&#x9762;&#x7684;&#x819C;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x9879;&#x51B3;&#x8BAE;&#xFF0C;LTC(4) &#x5408;&#x9176;&#x662F;&#x60CA;&#x4EBA;&#x5730;&#x76F8;&#x4F3C;&#x5FAE;&#x7C92;&#x4F53;&#x8C37;&#x80F1;&#x7518;&#x80BD; S-&#x8F6C;&#x79FB;&#x9176; 1&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x5C5E;&#x4E8E;&#x540C;&#x4E00;&#x57FA;&#x56E0;&#x5BB6;&#x65CF;&#xFF0C;&#x4F46;&#x5728; LTC(4) &#x5408;&#x9176;&#x5BF9;&#x5E95;&#x7269;&#x4E13;&#x4E00;&#x6027;&#x627F;&#x62C5;&#x5C0F;&#x5E8F;&#x5217;&#x6807;&#x8BC6;&#x548C;&#x6CA1;&#x6709;&#x76F8;&#x4F3C;&#x4E4B;&#x5904;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x65F6;&#x82B1;&#x751F;&#x56DB;&#x70EF;&#x9178;&#x548C;&#x8C37;&#x80F1;&#x7518;&#x80BD;&#x4EE3;&#x8C22;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x65B0;&#x89C1;&#x89E3;&#x3002;

&#x4EBA;&#x7C7B;&#x767D;&#x4E09;&#x70EF; C(4) &#x5408;&#x9176;&#x5728; 4.5 A &#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x6295;&#x5F71;&#x4E2D;&#x3002;

Leukotriene (LT) C(4) synthase, an 18 kDa integral membrane enzyme, conjugates LTA(4) with reduced glutathione to form LTC(4), the parent compound of all cysteinyl leukotrienes that play a crucial role in the pathobiology of bronchial asthma. We have calculated a projection map of recombinant human LTC(4) synthase at a resolution of 4.5 A by electron crystallography, which shows that the enzyme is a trimer. A map truncated at 7.5 A visualizes four transmembrane alpha helices per protein monomer. The densities in projection indicate that most of the alpha helices run nearly perpendicular to the plane of the membrane. At this resolution, LTC(4) synthase is strikingly similar to microsomal glutathione S-transferase 1, which belongs to the same gene family but bears little sequence identity and no resemblance in substrate specificity to the LTC(4) synthase. These results provide new insight into the structure and function of membrane proteins involved in eicosanoid and glutathione metabolism.

Human leukotriene C(4) synthase at 4.5 A resolution in projection.

Leucotri&#xE8;nes (LT) C (4) synthase, une enzyme de 18 kDa membrane int&#xE9;grale, conjugu&#xE9;s LTA (4) avec le glutathion r&#xE9;duit pour former LTC (4), le compos&#xE9; parent de tous les leucotri&#xE8;nes cyst&#xE9;inyl qui jouent un r&#xF4;le crucial dans la physiopathologie de l&#x26;#39;asthme bronchique . Nous avons calcul&#xE9; une projection cartographique de la LTC humaine recombinante (4) synthase &#xE0; une r&#xE9;solution de 4,5 A par cristallographie &#xE9;lectronique, ce qui montre que l&#x26;#39;enzyme est un trim&#xE8;re. Une carte tronqu&#xE9;e &#xE0; 7,5 A visualise quatre h&#xE9;lices alpha transmembranaires par monom&#xE8;re de prot&#xE9;ine. Les densit&#xE9;s de projection indiquent que la plupart des h&#xE9;lices alpha ex&#xE9;cuter pr&#xE8;s perpendiculaire au plan de la membrane. &#xC0; cette r&#xE9;solution, LTC (4) synthase est &#xE9;tonnamment similaire &#xE0; microsomale glutathion S-transf&#xE9;rase 1, qui appartient &#xE0; la m&#xEA;me famille de g&#xE8;nes, mais porte une identit&#xE9; de s&#xE9;quence peu et ne ressemble en rien &#xE0; la sp&#xE9;cificit&#xE9; de substrat de la LTC (4) synthase. Ces r&#xE9;sultats fournissent un nouvel &#xE9;clairage sur la structure et la fonction des prot&#xE9;ines membranaires impliqu&#xE9;es dans des eicosano&#xEF;des et le m&#xE9;tabolisme du glutathion.

Human leucotri&#xE8;nes C (4) synthase &#xE0; 4,5 Une r&#xE9;solution de la projection

Menschliche Leukotrien-C (4)-Synthase bei 4,5 A Aufl&#xF6;sung in der Projektion.

Leucotrieni (LT) c sintasi, un enzima di membrana integrale 18 kDa, coniugati LTA(4) con Glutatione ridotto alla forma LTC(4), il composto capostipite di tutti i leucotrieni cisteinici che giocano un ruolo cruciale nel pathobiology dell&#39;asma bronchiale. Noi abbiamo calcolato una mappa di proiezione di ricombinante umano LTC(4) sintasi ad una risoluzione di 4.5 A cristallografia di elettroni, che dimostra che l&#39;enzima &egrave; un trimero. Mappa troncata a 7,5 A Visualizza quattro transmembrane &alpha; eliche al monomero della proteina. La densit&agrave; in proiezione indicano che la maggior parte di &alpha; eliche eseguire quasi perpendicolare al piano della membrana. A questa risoluzione, LTC(4) sintasi sono sorprendentemente simile ai microsomi glutathione S-transferase 1, che appartiene alla stessa famiglia del gene, ma reca poco identit&agrave; di sequenza e alcuna somiglianza nella specificit&agrave; di substrato per la sintasi LTC(4). Questi risultati forniscono una nuova visione della struttura e funzione delle proteine di membrana coinvolte nel metabolismo del glutatione ed eicosanoid.

Umano leucotriene c sintasi a 4,5 risoluzione in proiezione.

&#x30ED;&#x30A4;&#x30B3;&#x30C8;&#x30EA;&#x30A8;&#x30F3;&#xFF08;LT&#xFF09;C&#xFF08;4&#xFF09;&#x9175;&#x7D20;&#x3001;18 kDa&#x306E;&#x819C;&#x5185;&#x5728;&#x6027;&#x9175;&#x7D20;&#x3001;LTC&#xFF08;4&#xFF09;&#x3001;&#x6C17;&#x7BA1;&#x652F;&#x5598;&#x606F;&#x306E;&#x75C5;&#x7406;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x306B;&#x304A;&#x3044;&#x3066;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30CB;&#x30EB;&#x30ED;&#x30A4;&#x30B3;&#x30C8;&#x30EA;&#x30A8;&#x30F3;&#x306E;&#x89AA;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x9084;&#x5143;&#x578B;&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x3068;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30B8;&#x30E5;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C8;LTA&#xFF08;4&#xFF09; &#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x9175;&#x7D20;&#x304C;&#x4E09;&#x91CF;&#x4F53;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x96FB;&#x5B50;&#x7DDA;&#x7D50;&#x6676;&#x5B66;&#x306B;&#x3088;&#x308B;4.5&#x306E;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x3067;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30D2;&#x30C8;LTC&#xFF08;4&#xFF09;&#x5408;&#x6210;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x6295;&#x5F71;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D7;&#x3092;&#x8A08;&#x7B97;&#x3057;&#x305F;&#x3002; 7.5&#x3067;&#x5207;&#x308A;&#x6368;&#x3066;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D7;&#x306F;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x5358;&#x91CF;&#x4F53;&#x3054;&#x3068;&#x306B;4&#x3064;&#x306E;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x3B1;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3092;&#x53EF;&#x8996;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x6295;&#x5F71;&#x306E;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x306F;&#x3B1;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x306F;&#x819C;&#x306E;&#x5E73;&#x9762;&#x306B;&#x307B;&#x307C;&#x5782;&#x76F4;&#x306B;&#x8D70;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x3067;&#x3001;LTC&#xFF08;4&#xFF09;&#x9175;&#x7D20;&#x306F;&#x540C;&#x3058;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30D5;&#x30A1;&#x30DF;&#x30EA;&#x30FC;&#x306B;&#x5C5E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x304C;&#x3001;&#x5C11;&#x3057;&#x914D;&#x5217;&#x540C;&#x4E00;&#x6027;&#x3068;LTC&#xFF08;4&#xFF09;&#x5408;&#x6210;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x306E;&#x306A;&#x3044;&#x4F3C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30DF;&#x30AF;&#x30ED;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;S-&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;1&#x3001;&#x3068;&#x9A5A;&#x304F;&#x307B;&#x3069;&#x4F3C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x30A8;&#x30A4;&#x30B3;&#x30B5;&#x30CE;&#x30A4;&#x30C9;&#x3068;&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306B;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

4.5&#x30D2;&#x30C8;&#x306E;&#x30ED;&#x30A4;&#x30B3;&#x30C8;&#x30EA;&#x30A8;&#x30F3;C&#xFF08;4&#xFF09;&#x5408;&#x6210;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x6295;&#x5F71;&#x306E;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;

Leukotriene (LT) C(4) synthase, 18 kDa &#xC815;&#xC218; &#xB9C9; &#xD6A8;&#xC18C; &#xAC10;&#xC18C; glutathione LTC(4), &#xAE30;&#xAD00;&#xC9C0; &#xCC9C;&#xC2DD;&#xC758; pathobiology&#xC5D0;&#xC11C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xD558;&#xB294; &#xBAA8;&#xB4E0; cysteinyl leukotrienes &#xBD80;&#xBAA8; &#xD654;&#xD569;&#xBB3C; &#xD615;&#xD0DC;&#xB97C; &#xAC00;&#xC9C4; LTA(4)&#xC744; &#xBCC0;&#xD654;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB294; &#xD2B8;&#xB9AC;&#xBA38; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC8FC;&#xB294; &#xC804;&#xC790; &#xACB0;&#xC815;&#xD559;, 4.5 A&#xC758; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xC778;&#xAC04; LTC(4) synthase&#xC758; &#xD504;&#xB85C;&#xC81D;&#xC158; &#xB9F5; &#xACC4;&#xC0B0;. 7.5 A&#xC5D0;&#xC11C; &#xC798;&#xB9B4; &#xC9C0;&#xB3C4; &#xC2DC;&#xAC01;&#xD654; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xC704;&#xCCB4; &#xB2F9; 4 &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xC54C;&#xD30C; &#xD3EC;&#xD568;. &#xD22C;&#xC601;&#xC5D0; &#xBC00;&#xB3C4; &#xC54C;&#xD30C; &#xD3EC;&#xD568; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84; &#xAC70;&#xC758; &#xB9C9;&#xC758; &#xD3C9;&#xBA74;&#xC5D0; &#xC218;&#xC9C1;&#xC778; &#xC2E4;&#xD589;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; LTC(4) synthase&#xB294; &#xAE30; &#xB9C9;&#xD788;&#xAC8C; microsomal glutathione S-&#xC804;&#xC774; 1, &#xB3D9;&#xC77C;&#xD55C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xAC00;&#xC871;&#xC5D0; &#xC18D;&#xD574; &#xC788;&#xC9C0;&#xB9CC; LTC(4) synthase&#xC5D0; &#xAE30;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC5D0; &#xC791;&#xC740; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; id&#xC640; &#xC804;&#xD600; &#xB2EE;&#xC740; &#xACF0; &#xD558;&#xB294; &#xBE44;&#xC2B7;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; eicosanoid &#xBC0F; glutathione &#xC2E0;&#xC9C4; &#xB300;&#xC0AC;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xACFC; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC778;&#xAC04;&#xC758; leukotriene C(4) synthase &#xD22C;&#xC601;&#xC5D0;&#xC11C; 4.5 A &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4;.

Leucotrieno (LT) C (4) sintasa, una enzima de 18 kDa de membrana integral, conjugados LTA (4) con glutati&#xF3;n reducido para formar LTC (4), el compuesto de origen de todos los cisteinil leucotrienos que juegan un papel crucial en la patobiolog&#xED;a del asma bronquial . Hemos calculado un mapa de proyecci&#xF3;n humana recombinante LTC (4) sintasa en una resoluci&#xF3;n de 4,5 A por cristalograf&#xED;a de electrones, lo que demuestra que la enzima es un tr&#xED;mero. Un mapa truncado en 7,5 Una visualiza cuatro h&#xE9;lices alfa transmembrana por mon&#xF3;mero prote&#xED;na. Las densidades de proyecci&#xF3;n indican que la mayor&#xED;a de las h&#xE9;lices alfa ejecutar casi perpendicular al plano de la membrana. En esta resoluci&#xF3;n, LTC (4) sintasa es sorprendentemente similar a microsomales glutation S-transferasa 1, que pertenece a la misma familia de genes, pero tiene una identidad de secuencia poco y no se parece en especificidad de sustrato para el LTC (4) sintasa. Estos resultados proporcionan una nueva comprensi&#xF3;n de la estructura y funci&#xF3;n de prote&#xED;nas de membrana que participan en el metabolismo de los eicosanoides y el glutati&#xF3;n.

Humanos leucotrieno C (4) sintasa en el 4,5 una resoluci&#xF3;n en la proyecci&#xF3;n

&#x4EBA;&#x4F53;&#x7EF4;&#x751F;&#x7D20; K &#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x8C37;&#x6C28;&#x915E;&#x7FA7;&#x5316;&#x9176;&#x7684;&#x5E73;&#x9762;&#x94A2;&#x7BA1;&#x4E8C;&#x7EF4; (2D) &#x6676;&#x4F53;&#x589E;&#x5927; dimyristoyl &#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x80C6;&#x78B1; (DMPC)&#x3002;&#x5947;&#x602A;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6676;&#x4F53;&#x4E0B;&#x9762;&#x7684;&#x8868;&#x5355;&#x76F8;&#x8F6C;&#x53D8;&#x6E29;&#x5EA6;&#x7684; DMPC &#x548C;&#x5F02;&#x5E38;&#x4F4E;&#x6469;&#x5C14;&#x8102;&#x8D28;-&#x86CB;&#x767D;&#x8D28; (LPR) &#x6BD4; 1&#xFF0C;&#x867D;&#x7136; 2D &#x6676;&#x4F53;&#x76F8;&#x53D8;&#x6E29;&#x5EA6;&#x660E;&#x663E;&#x9AD8;&#x4E8E; LPRs &#x4E0E;&#x91CD;&#x5EFA;&#x8102;&#x8D28;&#x7684;&#x4E0A;&#x65B9;&#x4F20;&#x7EDF;&#x65B9;&#x6CD5;&#x79CD;&#x690D;&#x3002;&#x6C34;&#x6676;&#x662F;&#x8FBE; 0.75 microm &#x77ED;&#x7EF4;&#x7684;&#x5E73;&#x9762;&#x7BA1;&#x548C;&#x81F3;&#x5C11; 1 microm &#x7684;&#x957F;&#x5EA6;&#x3002;&#x7531;&#x4E8E;&#x6676;&#x4F53;&#x7684;&#x5E73;&#x9762;&#x7BA1;&#x6027;&#x8D28;&#xFF0C;&#x5B58;&#x5728;&#x4E24;&#x4E2A;&#x683C;&#x5B50;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x88AB;&#x65CB;&#x8F6C;&#x8FD1; 90 &#x5EA6;&#x7684;&#x4E92;&#x76F8;&#x5C0A;&#x91CD;&#x3002;&#x6709;&#x5E8F;&#x7684;&#x9635;&#x5217;&#x5C55;&#x793A;&#x4E0E;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x5C3A;&#x5BF8; p12(1) &#x5E73;&#x9762;&#x7EC4;&#x5BF9;&#x79F0; = 83.7 A&#x3001; b = 76.6&#xFF0C;&gamma; = 91 &#x5EA6;&#x3002;&#x8BA1;&#x7B97;&#x4ECE;&#x56FE;&#x50CF;&#x7684;&#x6D88;&#x6781;&#x7684;&#x6295;&#x5F71;&#x5730;&#x56FE;&#x88AB;&#x6CBE;&#x6C61;&#x548C;&#x7535;&#x5B50;&#x51B7;&#x51BB;&#x7535;&#x955C;&#x6837;&#x54C1;&#x63ED;&#x793A;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x7EF4;&#x751F;&#x7D20; K &#x7684;&#x8C37;&#x6C28;&#x915E;&#x7FA7;&#x5316;&#x9176;&#x662F;&#x5355;&#x4F53;&#x3002;

&#x4E8C;&#x7EF4;&#x7684;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x7EF4;&#x751F;&#x7D20; K &#x7684;&#x8C37;&#x6C28;&#x915E;&#x7FA7;&#x5316;&#x9176;&#x7684;&#x7ED3;&#x6676;&#x3002;

Planar-tubular two-dimensional (2D) crystals of human vitamin K-dependent gamma-glutamyl carboxylase grow in the presence of dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC). Surprisingly, these crystals form below the phase transition temperature of DMPC and at the unusually low molar lipid-to-protein (LPR) ratio of 1, while 2D crystals are conventionally grown above the phase transition temperature of the reconstituting lipid and significantly higher LPRs. The crystals are up to 0.75 microm in the shorter dimension of the planar tubes and at least 1 microm in length. Due to the planar-tubular nature of the crystals, two lattices are present. These are rotated by nearly 90 degrees in respect to each other. The ordered arrays exhibit p12(1) plane group symmetry with unit cell dimensions of a=83.7 A, b=76.6 A, gamma=91 degrees. Projection maps calculated from images of negatively stained and electron cryo-microscopy samples reveal the human vitamin K-dependent gamma-glutamyl carboxylase to be a monomer.

Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent gamma-glutamyl carboxylase.

Plane-tubulaires bidimensionnelles (2D) de cristaux humaine vitamine K-d&#xE9;pendante la gamma-glutamyl-carboxylase cro&#xEE;tre en pr&#xE9;sence de dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC). Surprenante, ces cristaux former en dessous de la temp&#xE9;rature de transition de phase de DMPC et au anormalement faible molaire lipide-&#xE0;-prot&#xE9;ine (LPR) &#xE0; raison de 1, tandis que les cristaux sont classiquement 2D cultiv&#xE9;-dessus de la temp&#xE9;rature de transition de phase du lipide et la reconstitution LPR sensiblement plus &#xE9;lev&#xE9;s. Les cristaux sont &#xE0; 0,75 microm&#xE8;tre dans la dimension la plus courte des tubes planes et au moins 1 microM de longueur. En raison de la nature plane-tubulaire des cristaux, deux r&#xE9;seaux sont pr&#xE9;sents. Ceux-ci sont mis en rotation par pr&#xE8;s de 90 degr&#xE9;s par rapport &#xE0; l&#x26;#39;autre. Les jeux ordonn&#xE9;s pr&#xE9;sentent p12 (1) groupe de sym&#xE9;trie avion avec des dimensions de maille de a = 83,7 A, b = 76,6 A, gamma = 91 degr&#xE9;s. Cartes projection calcul&#xE9;e &#xE0; partir d&#x26;#39;images de coloration n&#xE9;gative et cryo-microscopie &#xE9;lectronique des &#xE9;chantillons r&#xE9;v&#xE8;lent l&#x26;#39;humain en vitamine K-d&#xE9;pendante la gamma-glutamyl carboxylase &#xEA;tre un monom&#xE8;re.

Deux dimensions de cristallisation de l&#x26;#39;homme en vitamine K-d&#xE9;pendante Gamma-glutamyl carboxylase

Planar-tubul&auml;re zweidimensionale (2D) Kristalle des menschlichen Vitamin K-abh&auml;ngigen Gamma-Glutamyl-Carboxylase wachsen in Gegenwart von Dimyristoyl Phosphatidylcholin (DMPC). &Uuml;berraschend, dass diese Kristalle bilden unterhalb der Phase &Uuml;bergang Temperatur DMPC und bei ungew&ouml;hnlich niedrigen molaren Lipid-Protein-(LPR) Verh&auml;ltnis 1, w&auml;hrend 2D Kristalle &uuml;ber der Phase &Uuml;bergang Temperatur der REKONSTITUTIERT Lipid und deutlich h&ouml;here LPRs konventionell angebaut werden. Die Kristalle sind bis 0,75 Microm in der k&uuml;rzeren Dimension der planaren Rohre und mindestens 1 Microm L&auml;nge. Aufgrund der planar-tubul&auml;re Beschaffenheit der Kristalle sind zwei Gitter vorhanden. Diese sind um fast 90 Grad in Bezug auf einander gedreht. Die bestellten Arrays weisen p12(1) Flugzeug Gruppe Symmetrie mit Einheit Zelle Ma&szlig;en ein 83,7 = A, b = 76,6 A, Gamma = 91 Grad. Projektion Karten berechnet von den Bildern der negativ gef&auml;rbt und Elektron-Cryo-Mikroskopie-Beispiele zeigen die menschliche Vitamin K-abh&auml;ngigen Gamma-Glutamyl-Carboxylase zu einem Monomer.

Zweidimensionale Kristallisation des menschlichen Vitamin K-abh&auml;ngigen Gamma-Glutamyl-Carboxylase.

Planar-tubolare cristalli bidimensionali (2D) di umano vitamina K-dipendente gamma-glutamil carbossilasi crescono in presenza di dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC). Sorprendentemente, questi cristalli forma sotto la temperatura di transizione di fase della DMPC e il rapporto di (LPR) lipido-proteina molare insolitamente bassa di 1, mentre 2D cristalli sono convenzionalmente cresciuti di sopra della temperatura di transizione di fase di ricostituzione dei lipidi e LPRs significativamente pi&ugrave; elevati. I cristalli sono fino a 0,75 microm nella dimensione pi&ugrave; breve dei tubi planare e almeno 1 microm in lunghezza. A causa della natura planare tubolare dei cristalli, sono presenti due reticoli. Queste vengono ruotate di circa 90 gradi rispetto alla vicenda. Le matrici ordinate esibiscono la simmetria di gruppo piano p12(1) con dimensioni cella unit&agrave; di un = 83,7 A, b = 76,6 un, gamma = 91 gradi. Mappe di proiezione calcolati negativamente dalle immagini di tinto e campioni di crio-microscopia elettronica rivelano l&#39;umano vitamina K-dipendente gamma-glutamil carbossilasi per essere un monomero.

Bidimensionale della cristallizzazione umano vitamina K-dipendente gamma-glutamil carbossilasi.

&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x30D3;&#x30BF;&#x30DF;&#x30F3;K&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x3B3;-&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30DF;&#x30EB;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x5E73;&#x9762;&#x7BA1;&#x72B6;&#x306E;2&#x6B21;&#x5143;&#xFF08;2D&#xFF09;&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x306F;&#x3001;&#x30B8;&#x30DF;&#x30EA;&#x30B9;&#x30C8;&#x30A4;&#x30EB;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30B3;&#x30EA;&#x30F3;&#xFF08;DMPC&#xFF09;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x6210;&#x9577;&#x3059;&#x308B;&#x3002; 2&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x306F;&#x3001;&#x5F93;&#x6765;&#x3001;&#x76F8;&#x8EE2;&#x79FB;&#x306E;&#x518D;&#x69CB;&#x6210;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E;&#x6E29;&#x5EA6;&#x3068;&#x6709;&#x610F;&#x306B;&#x9AD8;&#x3044;LPRs&#x4E0A;&#x306B;&#x6210;&#x9577;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x9593;&#x306B;&#x9A5A;&#x304F;&#x3079;&#x304D;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x306F;&#x3001;DMPC&#x306E;&#x76F8;&#x8EE2;&#x79FB;&#x6E29;&#x5EA6;&#x4EE5;&#x4E0B;&#x3068;1&#x306E;&#x7570;&#x5E38;&#x306B;&#x4F4E;&#x3044;&#x30E2;&#x30EB;&#x8102;&#x8CEA;&#x5BFE;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;LPR&#xFF09;&#x306E;&#x6BD4;&#x7387;&#x3067;&#x5F62;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D50;&#x6676;&#x306F;&#x3001;&#x5E73;&#x9762;&#x7BA1;&#x3068;&#x9577;&#x3055;&#x304C;&#x5C11;&#x306A;&#x304F;&#x3068;&#x3082;1&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30E2;&#x30EB;&#x306E;&#x77ED;&#x3044;&#x65B9;&#x306E;&#x6B21;&#x5143;&#x3067;0.75&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30E2;&#x30EB;&#x307E;&#x3067;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x7D50;&#x6676;&#x306E;&#x5E73;&#x9762;&#x7BA1;&#x72B6;&#x306E;&#x6027;&#x8CEA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x4E8C;&#x3064;&#x306E;&#x683C;&#x5B50;&#x304C;&#x5B58;&#x5728;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306F;&#x4E92;&#x3044;&#x306B;&#x307B;&#x307C;90&#x5EA6;&#x56DE;&#x8EE2;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9806;&#x5E8F;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x914D;&#x5217;&#x306F;&#x3001;P12&#xFF08;1&#xFF09;= 83.7 A&#x3001;B = 76.6 A&#x3001;&#x30AC;&#x30F3;&#x30DE;= 91&#x5EA6;&#x306E;&#x5358;&#x4F4D;&#x30BB;&#x30EB;&#x5BF8;&#x6CD5;&#x306E;&#x5E73;&#x9762;&#x7FA4;&#x5BFE;&#x79F0;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3002;&#x30CD;&#x30AC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x67D3;&#x8272;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x96FB;&#x5B50;&#x4F4E;&#x6E29;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x8A66;&#x6599;&#x306E;&#x753B;&#x50CF;&#x304B;&#x3089;&#x8A08;&#x7B97;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6295;&#x5F71;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D7;&#x306F;&#x3001;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x30D3;&#x30BF;&#x30DF;&#x30F3;K&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x3B3;-&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30DF;&#x30EB;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x3001;&#x30E2;&#x30CE;&#x30DE;&#x30FC;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x306A;&#x3063;&#x305F;&#x3002;

&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x30D3;&#x30BF;&#x30DF;&#x30F3;K&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x3B3;-&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30DF;&#x30EB;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x4E8C;&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;

&#xC778;&#xAC04; &#xBE44;&#xD0C0;&#xBBFC; K &#xC758;&#xC874; &#xAC10;&#xB9C8; glutamyl carboxylase&#xC758; &#xD3C9;&#xBA74; &#xAD00; 2 &#xCC28;&#xC6D0; (2D) &#xACB0;&#xC815; &#xC131;&#xC7A5; dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC)&#xC758; &#xC874;&#xC7AC;. &#xB180;&#xB78D;&#xAC8C;&#xB3C4;, &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xC815; &#xC544;&#xB798; &#xC591;&#xC2DD;&#xC744; &#xC704;&#xC0C1; &#xC804;&#xC774; &#xC628;&#xB3C4; DMPC&#xC640; 1, 2 &#xCC28;&#xC6D0; &#xACB0;&#xC815; reconstituting &#xC9C0;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD788; &#xB192;&#xC740; &#xAC08;&#xC544;&#xD0C0;&#xB294; &#xC704;&#xC0C1; &#xC804;&#xC774; &#xC628;&#xB3C4; &#xC774;&#xC0C1; &#xC7AC;&#xBC30; &#xB418; &#xACE0; &#xC804;&#xD1B5;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB3D9;&#xC548; &#xBE44;&#xC815;&#xC0C1;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB0AE;&#xC740; &#xC5B4; &#xAE08; &#xB2C8; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (LPR) &#xBE44;&#xC728;. &#xD06C;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xD0C8;&#xC740; &#xD3C9;&#xBA74; &#xD29C;&#xBE0C;&#xC758; &#xC9E7;&#xC740; &#xCE58;&#xC218;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCD5C;&#xB300; 0.75 microm&#xACFC; &#xCD5C;&#xC18C;&#xD55C; 1 microm &#xAE38;&#xC774;. &#xD06C;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xD0C8;&#xC758; &#xD3C9;&#xBA74; &#xAD00; &#xD2B9;&#xC131;&#xC0C1; &#xB450; &#xADF8;&#xB9B4;&#xC740; &#xC874;&#xC7AC; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB4E4;&#xC740; &#xC11C;&#xB85C; &#xAC8C; &#xC874;&#xC911;&#xC5D0; &#xAC70;&#xC758; 90&#xB3C4; &#xD68C;&#xC804; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC815;&#xB82C; &#xB41C; &#xBC30;&#xC5F4; &#xC804;&#xC2DC; p12(1) &#xBE44;&#xD589;&#xAE30; &#xADF8;&#xB8F9; &#xB300;&#xCE6D;&#xC758; &#xB2E8;&#xC704; &#xC140; &#xD06C;&#xAE30;&#xB294; 83.7 = A, b = 76.6, &#xAC10;&#xB9C8; = 91&#xB3C4;. &#xD504;&#xB85C;&#xC81D;&#xC158; &#xB9F5; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xACC4;&#xC0B0; &#xC2A4;&#xD14C;&#xC778;&#xB4DC;&#xACFC; &#xC804;&#xC790; &#xACF3;&#xC744; &#xC54C;&#xC544;&#xB0B4;&#xB294;-&#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xC0D8;&#xD50C; &#xACF5;&#xAC1C; &#xBAA8;&#xB178; &#xBA38; &#xB420; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xBE44;&#xD0C0;&#xBBFC; K &#xC758;&#xC874; &#xAC10;&#xB9C8; glutamyl carboxylase.

&#xC778;&#xAC04; &#xBE44;&#xD0C0;&#xBBFC; K &#xC758;&#xC874; &#xAC10;&#xB9C8; glutamyl carboxylase&#xC758; 2 &#xCC28;&#xC6D0; &#xACB0;&#xC815; &#xD654;.

Planar-tubulares bidimensionales (2D) de cristales humana dependiente de vitamina K gamma-glutamil carboxilasa crecer en presencia de fosfatidilcolina dimiristoil (DMPC). Sorprendentemente, estos cristales se forman por debajo de la temperatura de transici&#xF3;n de fase de DMPC y en la inusualmente baja molar l&#xED;pido a prote&#xED;na (LPR) proporci&#xF3;n de 1, mientras que los cristales 2D son convencionalmente crecido por encima de la temperatura de transici&#xF3;n de fase de los l&#xED;pidos y la reconstituci&#xF3;n de los LPR significativamente m&#xE1;s altos. Los cristales son de hasta 0,75 micras en la dimensi&#xF3;n m&#xE1;s corta de los tubos planos y por lo menos 1 micras en longitud. Debido a la naturaleza planar-tubular de los cristales, dos ret&#xED;culos est&#xE1;n presentes. Estos son girados por casi 90 grados con respecto a la otra. Los arreglos ordenados exhiben p12 (1) la simetr&#xED;a plano de grupo con las dimensiones de la celda unitaria de a = 83.7 a, b = 76,6 A, gamma = 91 grados. Los mapas de proyecci&#xF3;n calculados a partir de im&#xE1;genes de tinci&#xF3;n negativa y microscop&#xED;a electr&#xF3;nica de crio-muestras revelan la humana dependiente de vitamina K gamma-glutamil carboxilasa ser un mon&#xF3;mero.

Bidimensional La cristalizaci&#xF3;n de Humano dependiente de vitamina K gamma-glutamil carboxilasa

&#x5728;&#x4E0D;&#x65AD;&#x589E;&#x52A0;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x4FE1;&#x606F;&#x6B63;&#x5728;&#x83B7;&#x53D6;&#x7535;&#x5B50;&#x6676;&#x4F53;&#x5B66;&#x7684;&#x51B3;&#x8BAE;&#x3002;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x5728;&#x7535;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x548C;&#x56FE;&#x50CF;&#x5904;&#x7406;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x5DF2;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5728;&#x6570;&#x636E;&#x6536;&#x96C6;&#x548C;&#x89E3;&#x51B3;&#x901F;&#x5EA6;&#x65B9;&#x9762;&#x7684;&#x5DE8;&#x5927;&#x8FDB;&#x6B65;&#xFF0C;&#x7ED3;&#x6676;&#x7684;&#x4E00;&#x822C;&#x51C6;&#x5219;&#x9996;&#x5148;&#x5F00;&#x59CB;&#x51FA;&#x73B0;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#x4E8C;&#x7EF4;&#x7ED3;&#x6676;&#x672C;&#x8EAB;&#x5C06;&#x59CB;&#x7EC8;&#x9650;&#x5236;&#x56E0;&#x7D20;&#x7684;&#x8FD9;&#x79CD;&#x529F;&#x80FD;&#x5F3A;&#x5927;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5728;&#x7ED3;&#x6784;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x900F;&#x6790;&#x6D17;&#x6DA4;&#x5242;&#x53BB;&#x9664;&#x4E8C;&#x7EF4;&#x7ED3;&#x6676;&#x662F;&#x6700;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x6280;&#x672F;&#x3002;&#x56DB;&#x4E2A;&#x4E3B;&#x8981;&#x56E0;&#x7D20;&#x9700;&#x8981;&#x8003;&#x8651;&#x900F;&#x6790;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF1A; &#x86CB;&#x767D;&#x5236;&#x5907;&#x3001; &#x6D17;&#x6DA4;&#x5242;&#x3001; &#x8102;&#x8D28;&#x589E;&#x52A0;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x4EFB;&#x4F55;&#x6210;&#x5206;&#x8102;&#x8D28;&#x3001; &#x7F13;&#x51B2;&#x533A;&#x7684;&#x6761;&#x4EF6;&#x3002;&#x540C;&#x6837;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x662F;&#x9002;&#x5F53;&#x548C;&#x4ED4;&#x7EC6;&#x7684;&#x68C0;&#x67E5;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x786E;&#x5B9A;&#x4E8C;&#x7EF4;&#x6676;&#x4F53;&#x3002;

&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7535;&#x5B50;&#x6676;&#x4F53;&#x5B66;&#xFF1A; &#x4E8C;&#x7EF4;&#x7ED3;&#x6676;&#x548C;&#x7535;&#x955C;&#x68C0;&#x67E5;&#x3002;

Structural and functional information of membrane proteins at ever-increasing resolution is being obtained by electron crystallography. While a large amount of work on the development of methods for electron microscopy and image processing has resulted in tremendous advances in terms of speed of data collection and resolution, general guidelines for crystallization are first starting to emerge. Yet two-dimensional crystallization itself will always remain the limiting factor of this powerful approach in structural biology. Two-dimensional crystallization through detergent removal by dialysis is the most widely used technique. Four main factors need to be considered for the dialysis method: the protein preparation, the detergent, the lipid added as well as any constituent lipid, and the buffer conditions. Equally important is proper and careful screening to identify two-dimensional crystals.

Electron crystallography of membrane proteins: two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.

Les informations structurelles et fonctionnelles des prot&#xE9;ines membranaires &#xE0; de plus en plus la r&#xE9;solution est obtenue par cristallographie &#xE9;lectronique. Alors qu&#x26;#39;une grande quantit&#xE9; de travail sur le d&#xE9;veloppement de m&#xE9;thodes pour la microscopie &#xE9;lectronique et de traitement d&#x26;#39;image a donn&#xE9; lieu &#xE0; d&#x26;#39;&#xE9;normes progr&#xE8;s en termes de vitesse de collecte des donn&#xE9;es et la r&#xE9;solution, des lignes directrices g&#xE9;n&#xE9;rales pour la cristallisation sont d&#x26;#39;abord commencent &#xE0; &#xE9;merger. Pourtant, &#xE0; deux dimensions de cristallisation se sera toujours le facteur limitant de cette approche puissante en biologie structurale. Deux dimensions de cristallisation par l&#x26;#39;&#xE9;limination de d&#xE9;tergent par dialyse est la technique la plus largement utilis&#xE9;e. Quatre facteurs principaux doivent &#xEA;tre pris en consid&#xE9;ration pour la m&#xE9;thode de dialyse: la pr&#xE9;paration de prot&#xE9;ines, le d&#xE9;tergent, le lipide ajout&#xE9; ainsi que toute lipides constituant, et les conditions de tampon. Il est &#xE9;galement important de d&#xE9;pistage correct et prudent afin d&#x26;#39;identifier des cristaux bidimensionnels.

Cristallographie &#xE9;lectronique des prot&#xE9;ines membranaires: Deux dimensions de cristallisation et de d&#xE9;pistage par microscopie &#xE9;lectronique

Strukturelle und funktionelle Informationen von Membranproteinen zu immer h&ouml;heren Aufl&ouml;sung ergibt sich aus Elektron Kristallographie. W&auml;hrend eine gro&szlig;e Menge Arbeit auf die Entwicklung von Methoden f&uuml;r Elektronenmikroskopie und Bildverarbeitung enormen Fortschritte in Bezug auf die Geschwindigkeit der Datenerfassung und Aufl&ouml;sung gef&uuml;hrt hat, beginnen allgemeine Leitlinien f&uuml;r die Kristallisation zuerst zu entstehen. Zweidimensionale Kristallisation selbst bleibt noch immer der limitierende Faktor f&uuml;r diesen leistungsf&auml;higen Ansatz in Strukturbiologie. Zweidimensionale Kristallisation durch Waschmittel Beseitigung von Dialyse ist die am weitesten verbreitete Technik. Vier Hauptfaktoren f&uuml;r die Dialyse-Methode ber&uuml;cksichtigt werden m&uuml;ssen: die Protein-Vorbereitung, das Waschmittel, das Lipid hinzugef&uuml;gt sowie jeden konstituierende Lipid und die Puffer-Bedingungen. Ebenso ist wichtig richtige und sorgf&auml;ltige screening um zweidimensionale Kristalle zu identifizieren.

Elektron Kristallographie von Membranproteinen: zweidimensionale Kristallisation und Screening durch Elektronenmikroskopie.

Informazioni strutturali e funzionali delle proteine di membrana alla sempre maggiore risoluzione essendo ottenuto dalla cristallografia elettrone. Mentre una grande quantit&agrave; di lavoro sullo sviluppo di metodi per l&#39;elaborazione di immagine e microscopia elettronica ha portato enormi progressi in termini di velocit&agrave; di raccolta dei dati e risoluzione, le linee guida generali per cristallizzazione prima stanno iniziando a emergere. Ancora bidimensionale cristallizzazione stessa rimarr&agrave; sempre il fattore limitante di questo approccio potente in biologia strutturale. Cristallizzazione bidimensionale tramite rimozione detergente da dialisi &egrave; la tecnica pi&ugrave; largamente usata. Quattro fattori principali devono essere considerati per il metodo di dialisi: la preparazione della proteina, il detersivo, i lipidi lipidi aggiunto come pure ogni costituente e le condizioni di buffer. Altrettanto importante &egrave; corretta e attenta di screening per identificare i cristalli bi-dimensionali.

Cristallografia elettrone delle proteine di membrana: cristallizzazione bidimensionale e lo screening di microscopia elettronica.

&#x5897;&#x3048;&#x7D9A;&#x3051;&#x308B;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x3067;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x60C5;&#x5831;&#x306F;&#x3001;&#x96FB;&#x5B50;&#x7DDA;&#x7D50;&#x6676;&#x5B66;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x96FB;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3068;&#x753B;&#x50CF;&#x51E6;&#x7406;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x624B;&#x6CD5;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x306B;&#x95A2;&#x3059;&#x308B;&#x4F5C;&#x696D;&#x306E;&#x5927;&#x91CF;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x53CE;&#x96C6;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x306E;&#x901F;&#x5EA6;&#x306E;&#x9762;&#x3067;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x9032;&#x6B69;&#x3092;&#x3082;&#x305F;&#x3089;&#x3057;&#x305F;&#x4E00;&#x65B9;&#x3067;&#x3001;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x306E;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x30AC;&#x30A4;&#x30C9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x6700;&#x521D;&#x306B;&#x51FA;&#x73FE;&#x3057;&#x59CB;&#x3081;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x3060;&#x4E8C;&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x81EA;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;&#x5E38;&#x306B;&#x69CB;&#x9020;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x3067;&#x3053;&#x306E;&#x5F37;&#x529B;&#x306A;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306E;&#x5236;&#x9650;&#x56E0;&#x5B50;&#x306E;&#x307E;&#x307E;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x900F;&#x6790;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x754C;&#x9762;&#x6D3B;&#x6027;&#x5264;&#x306E;&#x9664;&#x53BB;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;2&#x3064;&#x306E;&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x304C;&#x6700;&#x3082;&#x5E83;&#x304F;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30C6;&#x30AF;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x8ABF;&#x88FD;&#x7269;&#x3001;&#x6D17;&#x5264;&#x3001;&#x8102;&#x8CEA;&#x304C;&#x8FFD;&#x52A0;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x4EFB;&#x610F;&#x306E;&#x69CB;&#x6210;&#x8102;&#x8CEA;&#x3001;&#x30D0;&#x30C3;&#x30D5;&#x30A1;&#x6761;&#x4EF6;&#xFF1A;4&#x3064;&#x306E;&#x4E3B;&#x306A;&#x8981;&#x56E0;&#x306F;&#x3001;&#x900F;&#x6790;&#x6CD5;&#x3092;&#x8003;&#x616E;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x4E8C;&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x9069;&#x5207;&#x304B;&#x3064;&#x614E;&#x91CD;&#x306A;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

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&#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0;&#xC815;&#xD559; &#xC804;&#xC790;: 2 &#xCC28;&#xC6D0; &#xACB0;&#xC815; &#xD654; &#xBC0F; &#xC804;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC2EC;&#xC0AC;.

La informaci&#xF3;n estructural y funcional de prote&#xED;nas de la membrana en cada vez mayor resoluci&#xF3;n est&#xE1; siendo obtenido por cristalograf&#xED;a de electrones. Mientras que una gran cantidad de trabajo en el desarrollo de m&#xE9;todos para la microscop&#xED;a electr&#xF3;nica y procesamiento de im&#xE1;genes ha dado lugar a grandes avances en t&#xE9;rminos de velocidad de la recolecci&#xF3;n de datos y la resoluci&#xF3;n, las pautas generales para la cristalizaci&#xF3;n es el primer comenzar a emerger. Sin embargo, la cristalizaci&#xF3;n de dos dimensiones en s&#xED; seguir&#xE1; siendo siempre el factor limitante de este enfoque de gran alcance en la biolog&#xED;a estructural. Dos dimensiones de cristalizaci&#xF3;n a trav&#xE9;s de la eliminaci&#xF3;n del detergente por di&#xE1;lisis es la t&#xE9;cnica m&#xE1;s ampliamente utilizada. Cuatro factores principales deben ser considerados para el m&#xE9;todo de di&#xE1;lisis: la preparaci&#xF3;n de prote&#xED;na, detergente la, a&#xF1;adi&#xF3; el l&#xED;pido as&#xED; como cualquier l&#xED;pido constituyente, y las condiciones de amortiguaci&#xF3;n. Igualmente importante es la adecuada selecci&#xF3;n y cuidadosa para identificar cristales de dos dimensiones.

Cristalograf&#xED;a de electrones de prote&#xED;nas de membrana: dos dimensiones de cristalizaci&#xF3;n y de detecci&#xF3;n por microscop&#xED;a electr&#xF3;nica

&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x6784;&#x4E0E;&#x529F;&#x80FD;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7531;&#x4E24;&#x4E2A;&#x529F;&#x80FD;&#x5F3A;&#x5927;&#x548C;&#x4E92;&#x8865;&#x6027;&#x5F88;&#x5F3A;&#x7684;&#x7535;&#x5B50;&#x51BB; (&#x4F4E;&#x6E29; EM) &#x65B9;&#x6CD5;&#x7814;&#x7A76;&#xFF1A; &#x7535;&#x5B50;&#x6676;&#x4F53;&#x5B66;&#x7684;&#x4E8C;&#x7EF4; (2D) &#x6676;&#x4F53;&#x548C;&#x6D17;&#x6DA4;&#x5242;&#x6EB6;&#x86CB;&#x767D;&#x590D;&#x5408;&#x4F53;&#x7684;&#x5355;&#x9897;&#x7C92;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x8981;&#x5C3D;&#x53EF;&#x80FD;&#x9AD8;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x6570;&#x636E;&#x83B7;&#x5F97;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x662F;&#x5426;&#x7F16;&#x5199;&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E8C;&#x7EF4;&#x6676;&#x4F53;&#x6216;&#x5355;&#x4E2A;&#x7C92;&#x5B50;&#xFF0C;&#x51B7;&#x51BB; EM &#x6837;&#x672C;&#x5FC5;&#x987B;&#x975E;&#x5E38;&#x5C0F;&#x5FC3;&#x9676;&#x5316;&#x3002;&#x53EF;&#x80FD;&#x56DE;&#x6CE8;&#x5C04;&#xFF0C;&#x78B3;&#x5939;&#x5C42;&#x6280;&#x672F;&#x4E4B;&#x524D;&#x5728;&#x7535;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x51B7;&#x5374;, &#x7684;&#x7CD6;&#x4E2D;&#x5E72;&#x71E5;&#x6216;&#x66B4;&#x8DCC;&#x51BB;&#x7ED3;&#x7F51;&#x683C;&#x4E8C;&#x7EF4;&#x6676;&#x4F53;&#x7684;&#x4F4E;&#x6E29; EM &#x7684;&#x51C6;&#x5907;&#x3002;&#x6807;&#x672C;&#x7F51;&#x683C;&#x4E3A;&#x5355;&#x4E2A;&#x7C92;&#x5B50;&#x4F4E;&#x6E29; EM &#x7814;&#x7A76;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x4EA7;&#x54C1;&#x901A;&#x5E38;&#x7531;&#x66B4;&#x8DCC;&#x51BB;&#x7ED3;&#x86CB;&#x767D;&#x6EB6;&#x6DB2;&#xFF0C;&#x652F;&#x6301;&#x8981;&#x4E48;&#x901A;&#x8FC7;&#x7A7F;&#x5B54;&#x6216;&#x8FDE;&#x7EED;&#x78B3;&#x8584;&#x819C;&#x886C;&#x5E95;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E00;&#x5BA1;&#x67E5;&#x6982;&#x8FF0;&#x4E86;&#x53EF;&#x4F9B;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x4E0D;&#x540C;&#x6280;&#x672F;&#x548C;&#x7279;&#x5B9A;&#x6837;&#x54C1;&#x548C;&#x7814;&#x7A76;&#x6BCF;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x9002;&#x7528;&#x6027;&#x3002;&#x5728;&#x6837;&#x54C1;&#x5236;&#x5907;&#x548C;&#x4FDD;&#x5B58;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x6CE8;&#x610F;&#x4E8B;&#x9879;&#x5305;&#x62EC;&#x672C;&#x8EAB;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x548C;&#x8102;&#x8D28;&#x6216;&#x6D17;&#x6DA4;&#x5242;&#x7684;&#x5B58;&#x5728;&#x3002;&#x5728;&#x4E0D;&#x540C;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x7684;&#x51B7;&#x51BB; EM &#x6837;&#x54C1;&#x7684;&#x5916;&#x89C2;&#x8FD8;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x4E86;&#x3002;

&#x7535;&#x5B50;&#x51BB;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#xFF1A; &#x6837;&#x54C1;&#x5236;&#x5907;&#x7684;&#x4E8C;&#x7EF4;&#x6676;&#x4F53;&#x548C;&#x5355;&#x4E2A;&#x9897;&#x7C92;&#x3002;

Membrane protein structure and function can be studied by two powerful and highly complementary electron cryomicroscopy (cryo-EM) methods: electron crystallography of two-dimensional (2D) crystals and single particle analysis of detergent-solubilized protein complexes. To obtain the highest-possible resolution data from membrane proteins, whether prepared as 2D crystals or single particles, cryo-EM samples must be vitrified with great care. Grid preparation for cryo-EM of 2D crystals is possible by back-injection, the carbon sandwich technique, drying in sugars before cooling in the electron microscope, or plunge-freezing. Specimen grids for single particle cryo-EM studies of membrane proteins are usually produced by plunge-freezing protein solutions, supported either by perforated or a continuous carbon film substrate. This review outlines the different techniques available and the suitability of each method for particular samples and studies. Experimental considerations in sample preparation and preservation include the protein itself and the presence of lipid or detergent. The appearance of cryo-EM samples in different conditions is also discussed.

Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.

La structure des prot&#xE9;ines membranaires et de la fonction peut &#xEA;tre &#xE9;tudi&#xE9;e par deux puissants et tr&#xE8;s compl&#xE9;mentaire cryo-microscopie &#xE9;lectronique (cryo-EM) m&#xE9;thodes: cristallographie &#xE9;lectronique de deux dimensions (2D) de cristaux et de l&#x26;#39;analyse seule particule de complexes prot&#xE9;iques solubilis&#xE9;s d&#xE9;tergent. Pour obtenir des donn&#xE9;es &#xE0; haute r&#xE9;solution le plus &#xE9;lev&#xE9;-possibles &#xE0; partir des prot&#xE9;ines membranaires, qu&#x26;#39;ils aient &#xE9;t&#xE9; pr&#xE9;par&#xE9;s sous forme de cristaux 2D ou des particules simples, cryo-EM &#xE9;chantillons doivent &#xEA;tre vitrifi&#xE9;s avec grand soin. Grille pour la pr&#xE9;paration cryo-EM de cristaux 2D est possible par r&#xE9;tro-injection, la technique du sandwich de carbone, le s&#xE9;chage en sucres avant de vous rafra&#xEE;chir dans le microscope &#xE9;lectronique, ou en plong&#xE9;e-gel. Grilles de sp&#xE9;cimen pour seule particule cryo-EM des &#xE9;tudes des prot&#xE9;ines membranaires sont g&#xE9;n&#xE9;ralement produites par des solutions de prot&#xE9;ines plongent au point de cong&#xE9;lation, soutenus soit par perfor&#xE9;e ou un substrat de carbone film continu. Cette revue d&#xE9;crit les diff&#xE9;rentes techniques disponibles et la pertinence de chaque m&#xE9;thode pour &#xE9;chantillons particuliers et des &#xE9;tudes. Consid&#xE9;rations exp&#xE9;rimentales en pr&#xE9;paration de l&#x26;#39;&#xE9;chantillon et la conservation comprennent la prot&#xE9;ine elle-m&#xEA;me et la pr&#xE9;sence de lipides ou de d&#xE9;tergent. L&#x26;#39;apparition de la cryo-EM &#xE9;chantillons dans des conditions diff&#xE9;rentes est &#xE9;galement discut&#xE9;.

Cryomicroscopie &#xE9;lectronique des prot&#xE9;ines membranaires: Pr&#xE9;paration des &#xE9;chantillons pour des cristaux bidimensionnels et des particules individuelles

Membran-Protein-Struktur und Funktion k&ouml;nnen durch zwei leistungsstarke und hoch erg&auml;nzende Elektron Cryomicroscopy (Cryo-EM) Methoden untersucht werden: Elektron Kristallographie der zweidimensionalen (2D) Kristalle und einzelnes Teilchen Analyse der Waschmittel-solubilized Proteinkomplexe. Um die h&ouml;chstm&ouml;gliche Aufl&ouml;sung-Daten von Membranproteinen, zu erhalten, ob als 2D Kristalle oder einzelne Teilchen bereit, m&uuml;ssen mit gro&szlig;er Sorgfalt Cryo-EM Proben verglast werden. Raster-Vorbereitung f&uuml;r Cryo-EM 2D Kristalle ist m&ouml;glich durch R&uuml;cken-Injektion, die Kohlenstoff-Sandwich-Bauweise, in Zucker vor Abk&uuml;hlung im Elektronenmikroskop Trocknen oder Sprung-Einfrieren. Probe-Raster f&uuml;r einzelnes Teilchen Cryo-EM Studien von Membranproteinen in der Regel die von Proteinl&ouml;sungen Sprung-Einfrieren werden sind, unterst&uuml;tzt entweder durch gelocht oder eine kontinuierliche Carbon film Substrat. Diesen Bericht werden die verschiedenen Techniken zur Verf&uuml;gung und die Eignung der einzelnen Methoden f&uuml;r bestimmte Beispiele und Studien. Experimentelle &Uuml;berlegungen bei der Probenvorbereitung und Erhaltung geh&ouml;ren das Protein selbst und das Vorhandensein von Lipid oder Reinigungsmittel. Die Darstellung der Cryo-EM Proben unter verschiedenen Bedingungen wird auch diskutiert.

Elektron-Cryomicroscopy von Membranproteinen: Probenvorbereitung f&uuml;r zweidimensionale Kristalle und einzelne Teilchen.

Funzione e struttura della proteina di membrana pu&ograve; essere studiati da due metodi di criomicroscopia (cryo-EM) elettroni potente e altamente complementari: cristallografia elettrone di cristalli bi-dimensionali (2D) e l&#39;analisi della singola particella di complessi proteici detergente-solubilizzato. Per ottenere i dati di risoluzione pi&ugrave; alta possibile da proteine di membrana, se preparato come 2D cristalli o singole particelle, campioni di cryo-EM devono essere vetrificati con grande cura. Preparazione di griglia per cryo-EM dei 2D cristalli &egrave; possibile da retro-iniezione, la tecnica sandwich di carbonio, essiccazione in zuccheri prima di raffreddamento nel microscopio elettronico, o tuffo-congelamento. Griglie esemplare per gli studi di cryo-EM di singola particella di proteine di membrana sono solitamente prodotte dalle soluzioni di proteina del tuffo-congelamento, supportato sia da perforati o un continuo carbonio substrato della pellicola. Questa recensione delinea le diverse tecniche disponibili e l&#39;idoneit&agrave; di ciascun metodo per particolari esempi e studi. Considerazioni sperimentali nella preparazione dei campioni e conservazione includono la proteina stessa e la presenza di lipidi o detergente. &Egrave; discusso anche l&#39;aspetto dei campioni di cryo-EM in condizioni diverse.

Elettrone criomicroscopia delle proteine di membrana: preparazione dei campioni per cristalli bi-dimensionali e singole particelle.

2&#x6B21;&#x5143;&#xFF08;2D&#xFF09;&#x7D50;&#x6676;&#x3068;&#x754C;&#x9762;&#x6D3B;&#x6027;&#x5264;&#x53EF;&#x6EB6;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x5358;&#x7C92;&#x5B50;&#x89E3;&#x6790;&#x306E;&#x96FB;&#x5B50;&#x7DDA;&#x7D50;&#x6676;&#x5B66;&#xFF1A;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306F;&#x4E8C;&#x3064;&#x3001;&#x5F37;&#x529B;&#x304B;&#x3064;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x306B;&#x88DC;&#x5B8C;&#x7684;&#x306A;&#x96FB;&#x5B50;&#x4F4E;&#x6E29;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x6CD5;&#xFF08;&#x30AF;&#x30E9;&#x30A4;&#x30AA;EM&#xFF09;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;&#x7814;&#x7A76;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3002;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x6700;&#x3082;&#x9AD8;&#x3044;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3092;&#x53D6;&#x5F97;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;2&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x53C8;&#x306F;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x7C92;&#x5B50;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6E96;&#x5099;&#x3059;&#x308B;&#x304B;&#x3069;&#x3046;&#x304B;&#x3001;&#x30AF;&#x30E9;&#x30A4;&#x30AA;EM&#x306E;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306F;&#x7D30;&#x5FC3;&#x306E;&#x6CE8;&#x610F;&#x3092;&#x6255;&#x3063;&#x3066;&#x30AC;&#x30E9;&#x30B9;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002; 2&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x306E;&#x30AF;&#x30E9;&#x30A4;&#x30AA;EM&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30B0;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x306E;&#x6E96;&#x5099;&#x306F;&#x3001;&#x30AB;&#x30FC;&#x30DC;&#x30F3;&#x30B5;&#x30F3;&#x30C9;&#x30A4;&#x30C3;&#x30C1;&#x96FB;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3067;&#x51B7;&#x5374;&#x3059;&#x308B;&#x524D;&#x306B;&#x3001;&#x7CD6;&#x306E;&#x4E7E;&#x71E5;&#x6280;&#x8853;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30D7;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B8;&#x51CD;&#x7D50;&#x306F;&#x3001;&#x30D0;&#x30C3;&#x30AF;&#x6CE8;&#x5165;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x7C92;&#x5B50;&#x30AF;&#x30E9;&#x30A4;&#x30AA;EM&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8A66;&#x6599;&#x30B0;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x901A;&#x5E38;&#x3001;&#x30D7;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B8;&#x51CD;&#x7D50;&#x306E;&#x7A7F;&#x5B54;&#x306E;&#x3044;&#x200B;&#x200B;&#x305A;&#x308C;&#x304B;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x30B5;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x6EB6;&#x6DB2;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x9023;&#x7D9A;&#x3057;&#x305F;&#x70AD;&#x7D20;&#x819C;&#x306E;&#x57FA;&#x677F;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30EC;&#x30D3;&#x30E5;&#x30FC;&#x306F;&#x4F7F;&#x7528;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x6280;&#x8853;&#x3084;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x3068;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5404;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306E;&#x9069;&#x5408;&#x6027;&#x3092;&#x307E;&#x3068;&#x3081;&#x305F;&#x3082;&#x306E;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306E;&#x6E96;&#x5099;&#x3068;&#x4FDD;&#x5B58;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x7684;&#x306A;&#x8003;&#x616E;&#x4E8B;&#x9805;&#x306F;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x81EA;&#x4F53;&#x3084;&#x8102;&#x8CEA;&#x3084;&#x754C;&#x9762;&#x6D3B;&#x6027;&#x5264;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x6761;&#x4EF6;&#x3067;&#x306E;&#x30AF;&#x30E9;&#x30A4;&#x30AA;EM&#x306E;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306E;&#x5916;&#x89B3;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x3082;&#x8B70;&#x8AD6;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x4F4E;&#x6E29;&#x96FB;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#xFF1A;2&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x3068;&#x5358;&#x4E00;&#x7C92;&#x5B50;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8A66;&#x6599;&#x4F5C;&#x88FD;

&#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xAC15;&#xB825; &#xD558; &#xACE0; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xBCF4;&#xC644; &#xC804;&#xC790; cryomicroscopy (&#xACF3;&#xC744; &#xC54C;&#xC544;&#xB0B4;&#xB294;-EM) &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB85C; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xACF5;&#xBD80; &#xC218;: 2 &#xCC28;&#xC6D0; (2D) &#xACB0;&#xC815; &#xBC0F; &#xC138;&#xC81C; solubilized &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBCF5;&#xD569;&#xBB3C;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC785;&#xC790; &#xBD84;&#xC11D;&#xC758; &#xC804;&#xC790; &#xACB0;&#xC815;&#xD559;. 2D &#xD06C;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xD0C8; &#xB610;&#xB294; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC785;&#xC790; &#xC900;&#xBE44; &#xC5EC;&#xBD80; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xCD5C;&#xACE0; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB97C; &#xAD6C;&#xD558;&#xB294; &#xACF3;&#xC744; &#xC54C;&#xC544;&#xB0B4;&#xB294;-EM &#xC0D8;&#xD50C; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC138; &#xC2EC;&#xD558;&#xAC8C; vitrified &#xD574;&#xC57C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. 2D &#xD06C;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xD0C8;&#xC758; &#xACF3;&#xC744; &#xC54C;&#xC544;&#xB0B4;&#xB294;-&#xADF8;&#xB4E4;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xADF8;&#xB9AC;&#xB4DC; &#xC900;&#xBE44; &#xD0C4;&#xC18C; &#xC0CC;&#xB4DC;&#xC704;&#xCE58; &#xAE30;&#xBC95;, &#xC804;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB0C9;&#xAC01; &#xD558;&#xAE30; &#xC804;&#xC5D0; &#xC124;&#xD0D5; &#xAC74;&#xC870; &#xB610;&#xB294; &#xC2DD;&#xC774; &#xC5BC;&#xC5B4; &#xB2E4;&#xC2DC; &#xC8FC;&#xC785; &#xD558; &#xC5EC; &#xAC00;&#xB2A5; &#xD558;&#xB2E4;. &#xD45C;&#xBCF8; &#xACA9;&#xC790; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC785;&#xC790; &#xACF3;&#xC744; &#xC54C;&#xC544;&#xB0B4;&#xB294;-EM &#xC5F0;&#xAD6C; &#xB3CC;&#xC785; &#xB3D9;&#xACB0; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC9C0;&#xC6D0; &#xD558;&#xB098; &#xC5EC; &#xCC9C;&#xACF5; &#xB610;&#xB294; &#xC5F0;&#xC18D; &#xD0C4;&#xC18C; &#xD544;&#xB984; &#xAE30;&#xD310;. &#xC774; &#xAC80;&#xD1A0;&#xB294; &#xB2E4;&#xB978; &#xAE30;&#xBC95;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xBC0F; &#xD2B9;&#xC815; &#xC0D8;&#xD50C; &#xBC0F; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC01; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xC801;&#xD569;&#xC131;&#xC744; &#xC124;&#xBA85;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC0D8;&#xD50C; &#xC900;&#xBE44;&#xC640; &#xBCF4;&#xC874;&#xC758; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xACE0;&#xB824;&#xD574; &#xC790;&#xCCB4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xACFC; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xB610;&#xB294; &#xC138;&#xC81C;&#xC758; &#xC874;&#xC7AC;. &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xACF3;&#xC744; &#xC54C;&#xC544;&#xB0B4;&#xB294;-EM &#xC0D8;&#xD50C;&#xC758; &#xBAA8;&#xC591; &#xB610;&#xD55C; &#xB17C;&#xC758; &#xD588;&#xB2E4;.

&#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC804;&#xC790; cryomicroscopy: &#xB2E8;&#xC77C; &#xC785;&#xC790;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; 2 &#xCC28;&#xC6D0; &#xACB0;&#xC815; &#xACAC;&#xBCF8; &#xC900;&#xBE44;.

La estructura y funci&#xF3;n de prote&#xED;nas de membrana pueden ser estudiados por los dos poderosos y altamente complementaria criomicroscop&#xED;a electr&#xF3;nica (crio-ME) m&#xE9;todos: cristalograf&#xED;a de electrones de dos dimensiones (2D) y el an&#xE1;lisis de cristales sola part&#xED;cula de complejos de prote&#xED;nas solubilizadas en detergente. Para obtener los datos de resoluci&#xF3;n m&#xE1;s alta posible de prote&#xED;nas de la membrana, ya sea preparado en forma de cristales en 2D o part&#xED;culas individuales, la crio-ME muestras deben ser vitrificados con mucho cuidado. Preparaci&#xF3;n de cuadr&#xED;cula de la crio-ME de cristales 2D es posible por detr&#xE1;s de la inyecci&#xF3;n, la t&#xE9;cnica de s&#xE1;ndwich de carbono, secado en az&#xFA;cares antes de enfriar en el microscopio electr&#xF3;nico, o ca&#xED;da de congelaci&#xF3;n. Las redes de muestras de part&#xED;culas individuales crio-ME estudios de las prote&#xED;nas de membrana son producidos generalmente por las soluciones de prote&#xED;nas de congelaci&#xF3;n de inmersi&#xF3;n, con el apoyo, ya sea por perforaci&#xF3;n o un sustrato de pel&#xED;cula de carbono continua. Esta revisi&#xF3;n resume las diferentes t&#xE9;cnicas disponibles y la idoneidad de cada m&#xE9;todo en particular para las muestras y estudios. Consideraciones experimentales en la preparaci&#xF3;n de muestras y preservaci&#xF3;n incluyen la propia prote&#xED;na y la presencia de l&#xED;pidos o detergente. La aparici&#xF3;n de la crio-ME muestras en diferentes condiciones tambi&#xE9;n se discute.

Electron criomicroscop&#xED;a de prote&#xED;nas de membrana: Preparaci&#xF3;n de las muestras de cristales bidimensionales y de las part&#xED;culas individuales

Myocilin &#x662F;&#x4E00;&#x79CD;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5916;&#x57FA;&#x8D28;&#x7684;&#x5C0F;&#x6881;&#x7F51;&#x7EC4;&#x7EC7;&#xFF0C;&#x53C2;&#x4E0E;&#x8C03;&#x8282;&#x773C;&#x538B;&#x773C;&#x7684;&#x89E3;&#x5256;&#x533A;&#x57DF;&#x4E2D;&#x627E;&#x5230;&#x3002;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; (WT) myocilin &#x5DF2;&#x4E0E;&#x6FC0;&#x7D20;&#x6027;&#x9752;&#x5149;&#x773C;&#x3001; &#x5173;&#x8054;&#x548C; myocilin &#x7684;&#x53D8;&#x79CD;&#x5DF2;&#x94FE;&#x63A5;&#x5230;&#x65E9;&#x671F;&#x53D1;&#x75C5;&#x7EE7;&#x627F;&#x9752;&#x5149;&#x773C;&#x3002;&#x6C34;&#x5E73;&#x5347;&#x9AD8;&#x548C; myocilin &#x805A;&#x5408;&#x5230;&#x89C6;&#x795E;&#x7ECF;&#x52A0;&#x901F;&#x773C;&#x538B;&#x5347;&#x9AD8;&#x53CA;&#x9752;&#x5149;&#x773C;&#x7279;&#x5F81;&#x89C6;&#x529B;&#x4E27;&#x5931;&#x9020;&#x6210;&#x4E0D;&#x53EF;&#x9006;&#x8F6C;&#x7684;&#x635F;&#x5BB3;&#x3002;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x5BF9;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5185;&#x79EF;&#x7D2F;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x548C;&#x4F53;&#x5916; WT myocilin&#x3001; &#x7EC6;&#x80DE;&#x57F9;&#x517B;&#x548C;&#x6A21;&#x5F0F;&#x751F;&#x7269;&#x7684;&#x62A5;&#x544A;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x805A;&#x5408;&#x6709;&#x4E0D;&#x7ED3;&#x6784;&#x7279;&#x70B9;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x9879;&#x5DE5;&#x4F5C;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x63D0;&#x4F9B;&#x805A;&#x5408;&#x5F62;&#x5F0F;&#x7684; WT &#x6DC0;&#x7C89;&#x6837;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x7684;&#x7279;&#x5F81;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x7269;&#x7406;&#x8BC1;&#x636E;&#x548C;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53; myocilin &#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x4E3A; C &#x7EC8;&#x7AEF; olfactomedin (&#x5965;) &#x57DF;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x4EE5;&#x5F62;&#x6838;&#x4F9D;&#x8D56;&#x548C;&#x81EA;&#x8513;&#x5EF6;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x5728;&#x5404;&#x79CD;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x751F;&#x957F;&#x3002;Protofibrillar &#x4F4E;&#x805A;&#x7269;&#x548C;&#x6210;&#x719F;&#x7684;&#x6DC0;&#x7C89;&#x6837;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x662F;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x4F53;&#x5916;&#x3002;&#x5168;&#x957F;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53; myocilin &#x5728;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x8868;&#x8FBE;&#x5F62;&#x5F0F;&#x80DE;&#x5185;&#x542B;&#x6709;&#x6DC0;&#x7C89;&#x6837;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x805A;&#x5408;&#x4EE5;&#x53CA;&#x3002;&#x4E24;&#x8005;&#x5408;&#x8BA1;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x9879;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x65B0;&#x7684;&#x89C1;&#x89E3;&#x548C;&#x5F15;&#x53D1;&#x65B0;&#x7684;&#x95EE;&#x9898;&#xFF0C;&#x6709;&#x5173;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x5C5E;&#x6027;&#x7684;&#x9AD8;&#x4FDD;&#x5B88;&#x5965;&#x57DF;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x9752;&#x5149;&#x773C;&#x53D1;&#x75C5;&#x4E2D;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x8FDB;&#x884C;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x7684;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x5728;&#x4E34;&#x5E8A;&#x73AF;&#x5883;&#x4E2D;&#x7684;&#x65B0;&#x578B;&#x57FA;&#x4E8E;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x5047;&#x8BF4;&#x3002;

&#x6DC0;&#x7C89;&#x6837;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x5F62;&#x6210;&#x7684;&#x9752;&#x5149;&#x773C;&#x5173;&#x8054;&#x7684; Myocilin Olfactomedin &#x57DF;&#x3002;

Myocilin is a protein found in the extracellular matrix of trabecular meshwork tissue, the anatomical region of the eye involved in regulating intraocular pressure. Wild-type (WT) myocilin has been associated with steroid-induced glaucoma, and variants of myocilin have been linked to early-onset inherited glaucoma. Elevated levels and aggregation of myocilin hasten increased intraocular pressure and glaucoma-characteristic vision loss due to irreversible damage to the optic nerve. In spite of reports on the intracellular accumulation of mutant and WT myocilin in vitro, cell culture, and model organisms, these aggregates have not been structurally characterized. In this work, we provide biophysical evidence for the hallmarks of amyloid fibrils in aggregated forms of WT and mutant myocilin localized to the C-terminal olfactomedin (OLF) domain. These fibrils are grown under a variety of conditions in a nucleation-dependent and self-propagating manner. Protofibrillar oligomers and mature amyloid fibrils are observed in vitro. Full-length mutant myocilin expressed in mammalian cells forms intracellular amyloid-containing aggregates as well. Taken together, this work provides new insights into and raises new questions about the molecular properties of the highly conserved OLF domain, and suggests a novel protein-based hypothesis for glaucoma pathogenesis for further testing in a clinical setting.

Amyloid Fibril Formation by the Glaucoma-Associated Olfactomedin Domain of Myocilin.

Myociline est une prot&#xE9;ine qui se trouve dans la matrice extracellulaire du tissu trab&#xE9;culaire, la r&#xE9;gion anatomique de l&#x26;#39;&#x153;il impliqu&#xE9; dans la r&#xE9;gulation de la pression intraoculaire. De type sauvage (WT) myociline a &#xE9;t&#xE9; associ&#xE9;e &#xE0; un glaucome cortisonique, et des variantes de myociline ont &#xE9;t&#xE9; li&#xE9;s &#xE0; l&#x26;#39;apparition pr&#xE9;coce du glaucome a h&#xE9;rit&#xE9;. Des niveaux &#xE9;lev&#xE9;s d&#x26;#39;agr&#xE9;gation et de h&#xE2;ter myociline augmentation de la pression intraoculaire et la perte de vision glaucome caract&#xE9;ristique d&#xFB; &#xE0; des dommages irr&#xE9;versibles au nerf optique. En d&#xE9;pit des rapports sur l&#x26;#39;accumulation intracellulaire de mutant et WT myociline in vitro, culture cellulaire, et des organismes mod&#xE8;les, ces agr&#xE9;gats n&#x26;#39;ont pas &#xE9;t&#xE9; structurellement caract&#xE9;ris&#xE9;s. Dans ce travail, nous apportons la preuve biophysique pour les ma&#xEE;tres mots de fibrilles amylo&#xEF;des dans les formes agr&#xE9;g&#xE9;es de WT et mutante myociline localis&#xE9; &#xE0; l&#x26;#39;extr&#xE9;mit&#xE9; C-terminale olfactom&#xE9;dine (OLF) de domaine. Ces fibrilles sont cultiv&#xE9;es sous une vari&#xE9;t&#xE9; de conditions, d&#x26;#39;une mani&#xE8;re d&#xE9;pendante de la nucl&#xE9;ation et l&#x26;#39;auto-propagation. Oligom&#xE8;res Protofibrillar et fibrilles amylo&#xEF;des matures sont observ&#xE9;s in vitro. Sur toute la longueur myociline mutant exprim&#xE9; dans les cellules de mammif&#xE8;res formes intracellulaires amylo&#xEF;de contenant des agr&#xE9;gats ainsi. Pris dans leur ensemble, ce travail donne un nouvel aper&#xE7;u et soul&#xE8;ve de nouvelles questions sur les propri&#xE9;t&#xE9;s mol&#xE9;culaires du domaine hautement conserv&#xE9;e OLF, et sugg&#xE8;re un roman &#xE0; base de prot&#xE9;ines hypoth&#xE8;se pour le glaucome pathogen&#xE8;se pour d&#x26;#39;autres tests dans un contexte clinique.

Formation de fibrilles amylo&#xEF;des par le domaine du glaucome-Associated olfactom&#xE9;dine de myociline

Myocilin ist ein Protein in der extrazellul&auml;ren Matrix der trabekul&auml;ren Netzwerk Gewebe, der anatomischen Region des Auges bei der Regulierung des Augeninnendrucks beteiligt. Wildtyp (WT) Myocilin wurde mit Steroid-induzierte Glaukom verkn&uuml;pft und Varianten der Myocilin fr&uuml;h beginnende geerbten Glaukom verkn&uuml;pft wurden. Erh&ouml;hte Niveaus und Aggregation von Myocilin beeile erh&ouml;hte Augeninnendruck und Glaukom-Merkmal Sehverlust durch irreversible Sch&auml;den an den Sehnerv. Trotz der Berichte &uuml;ber die intrazellul&auml;re Ansammlung von Mutant und WT-Myocilin in-vitro, Zellkultur und Modellorganismen haben diese Aggregate nicht strukturell charakterisiert. In dieser Arbeit wir liefern biophysikalische Beweis f&uuml;r die Markenzeichen des Amyloid-Fibrillen in aggregierter Form des WT und mutant Myocilin auf der C-terminalen Olfactomedin (OLF) Dom&auml;ne lokalisiert. Diese Fibrillen sind unter verschiedensten Bedingungen eine Keimbildung-abh&auml;ngige und b&ouml;sartiger Weise gewachsen. Protofibrillar Oligomere und Reife Amyloid-Fibrillen sind in-vitro beobachtet. In mutant Myocilin ausgedr&uuml;ckt in den S&auml;ugetier-Zellen Formen intrazellul&auml;re Amyloid-haltige Aggregate sowie. Zusammen genommen, diese Arbeit bietet neue Einblicke in wirft neue Fragen &uuml;ber die molekularen Eigenschaften der stark konservierten OLF Dom&auml;ne und schl&auml;gt eine neuartige Protein basierende Hypothese f&uuml;r Glaukom Pathogenese f&uuml;r weitere Tests in einer klinischen Einstellung.

Amyloid Fibrille Formation von Glaukom-assoziierte Olfactomedin Bereich der Myocilin.

Myocilin &egrave; una proteina che si trova nella matrice extracellulare del tessuto trabecolato, la regione anatomica dell&#39;occhio coinvolto nella regolazione della pressione intraoculare. Wild-type (WT) myocilin &egrave; stato associato con glaucoma steroide-indotto, e varianti di myocilin sono stati collegati al glaucoma ereditaria ad esordio precoce. Livelli elevati e l&#39;aggregazione dei myocilin accelerare l&#39;aumento della pressione intraoculare e glaucoma-caratteristica visione perdita a causa di danni irreversibili al nervo ottico. Nonostante i rapporti sull&#39;accumulo intracellulare di mutante WT myocilin in vitro, coltura delle cellule e organismi modello, questi aggregati sono non stati strutturalmente caratterizzati. In questo lavoro, forniamo prove biofisiche per i tratti distintivi di fibrille amiloidi in forme aggregate di WT e mutante myocilin localizzato a olfactomedin il C-terminale dominio (OLF). Queste fibrille sono cresciute sotto una variet&agrave; di condizioni in maniera dipendente dalla nucleazione e auto-moltiplicazione. Protofibrillar oligomeri e maturi fibrille amiloidi sono osservati in vitro. Full-length myocilin mutante espresso in cellule di mammifero forme intracellulari contenenti amiloide aggregati pure. Presi insieme, questo lavoro fornisce nuove intuizioni e genera nuove domande circa le propriet&agrave; molecolari del dominio OLF altamente conservata e suggerisce un&#39;ipotesi basata su proteine romanzo per patogenesi del glaucoma per ulteriori test in un ambiente clinico.

Formazione di fibrillare amiloide da Glaucoma-Associated Olfactomedin dominio di Myocilin.

Myocilin&#x306F;&#x3001;&#x5C0F;&#x67F1;&#x7DB2;&#x7D44;&#x7E54;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3001;&#x773C;&#x5727;&#x306E;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x773C;&#x306E;&#x89E3;&#x5256;&#x5B66;&#x7684;&#x9818;&#x57DF;&#x306B;&#x898B;&#x51FA;&#x3055;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#xFF08;WT&#xFF09;myocilin&#x306F;&#x30B9;&#x30C6;&#x30ED;&#x30A4;&#x30C9;&#x8A98;&#x767A;&#x6027;&#x7DD1;&#x5185;&#x969C;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3001;&#x3068;myocilin&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;&#x7DD1;&#x5185;&#x969C;&#x3092;&#x7D99;&#x627F;&#x3057;&#x305F;&#x65E9;&#x671F;&#x767A;&#x75C7;&#x578B;&#x306B;&#x30EA;&#x30F3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002; myocilin&#x306E;&#x4E0A;&#x6607;&#x3068;&#x51DD;&#x96C6;&#x304C;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x773C;&#x5727;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x8996;&#x795E;&#x7D4C;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x9006;&#x7684;&#x306A;&#x640D;&#x50B7;&#x306B;&#x8D77;&#x56E0;&#x3059;&#x308B;&#x7DD1;&#x5185;&#x969C;&#x7279;&#x6027;&#x8996;&#x529B;&#x4F4E;&#x4E0B;&#x3092;&#x65E9;&#x3081;&#x308B;&#x3002;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x3068;in vitro&#x3067;&#x306E;WT myocilin&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x57F9;&#x990A;&#x3001;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x751F;&#x7269;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x84C4;&#x7A4D;&#x306E;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x51DD;&#x96C6;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;&#x69CB;&#x9020;&#x7684;&#x306B;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;C&#x672B;&#x7AEF;olfactomedin&#xFF08;OLF&#xFF09;&#x306E;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x5C40;&#x5728;&#x3059;&#x308B;WT&#x3068;&#x5909;&#x7570;myocilin&#x306E;&#x96C6;&#x7D04;&#x5F62;&#x3067;&#x30A2;&#x30DF;&#x30ED;&#x30A4;&#x30C9;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x306E;&#x9855;&#x8457;&#x306A;&#x7279;&#x5FB4;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x751F;&#x7269;&#x7269;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x8A3C;&#x62E0;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x306F;&#x6838;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3001;&#x81EA;&#x5DF1;&#x5897;&#x6B96;&#x7684;&#x306B;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x683D;&#x57F9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; Protofibrillar&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x3068;&#x6210;&#x719F;&#x3057;&#x305F;&#x30A2;&#x30DF;&#x30ED;&#x30A4;&#x30C9;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x306F;&#x3001;in vitro&#x3067;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x54FA;&#x4E73;&#x52D5;&#x7269;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x767A;&#x73FE;&#x5B8C;&#x5168;&#x306A;&#x9577;&#x3055;&#x306E;&#x5909;&#x7570;myocilin&#x3082;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30ED;&#x30A4;&#x30C9;&#x542B;&#x6709;&#x51DD;&#x96C6;&#x4F53;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x4F5C;&#x54C1;&#x306F;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3001;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x306B;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;OLF&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x7279;&#x6027;&#x306B;&#x95A2;&#x3059;&#x308B;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x554F;&#x984C;&#x3092;&#x63D0;&#x8D77;&#x3057;&#x3001;&#x81E8;&#x5E8A;&#x73FE;&#x5834;&#x3067;&#x306E;&#x3055;&#x3089;&#x306A;&#x308B;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x7DD1;&#x5185;&#x969C;&#x306E;&#x75C5;&#x56E0;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x898F;&#x306A;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x4EEE;&#x8AAC;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

Myocilin&#x306E;&#x7DD1;&#x5185;&#x969C;&#x95A2;&#x9023;Olfactomedin&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30A2;&#x30DF;&#x30ED;&#x30A4;&#x30C9;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x5F62;&#x6210;

Myocilin &#xBC30;&#xC218; &#xCC44;&#xB110; &#xC870;&#xC9C1;, &#xC548;&#xAD6C; &#xB0B4;&#xBD80; &#xC555;&#xB825; &#xC870;&#xC808;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xB208;&#xC758; &#xD574; &#xBD80; &#xC9C0;&#xC5ED; &#xAE30;&#xC9C8; &#xC788;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC57C;&#xC0DD;-&#xD0C0;&#xC785; (WT) myocilin &#xC2A4;&#xD14C;&#xB85C;&#xC774;&#xB4DC; &#xC720;&#xBC1C; &#xB179; &#xB0B4;&#xC7A5;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB418;&#xC5C8;&#xC73C;&#xBA70; myocilin&#xC758; &#xBCC0;&#xC885; &#xC0C1;&#xC18D; &#xB41C; &#xB179; &#xB0B4;&#xC7A5; &#xBC1C;&#xBCD1; &#xCD08;&#xAE30;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB192;&#xC740; &#xC218;&#xC900; &#xBC0F; myocilin&#xC758; &#xC9D1;&#xACC4; &#xC2DC; &#xC2E0;&#xACBD;&#xC5D0; &#xC548;&#xAD6C; &#xB0B4;&#xBD80; &#xC555;&#xB825;&#xC774; &#xC99D;&#xAC00; &#xD558; &#xACE0; &#xB3CC;&#xC774;&#xD0AC; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; &#xC190;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xC778;&#xD574; &#xB179; &#xB0B4;&#xC7A5; &#xD2B9;&#xC131; &#xC2DC;&#xB825; &#xC0C1;&#xC2E4;&#xC744; &#xC11C;&#xB450;&#xB974;&#xB294;. &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; WT myocilin &#xCCB4; &#xC678;, &#xC138;&#xD3EC; &#xBC30;&#xC591; &#xBC0F; &#xBAA8;&#xB378; &#xC0DD;&#xBB3C;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xCD95;&#xC801;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;, &#xBD88;&#xAD6C; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC9D1;&#xACC4;&#xB294; &#xB418;&#xC9C0; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD2B9;&#xC9D5; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC791;&#xD488;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC; WT&#xC758; &#xC9D1;&#xACC4; &#xB41C; &#xD615;&#xD0DC;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xB179;&#xB9D0; &#xCCB4; &#xC18C;&#xC758; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xB9AC; &#xC99D;&#xAC70; &#xBC0F; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; myocilin &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; C &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; olfactomedin (OLF) &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC18C; nucleation &#xC885;&#xC18D; &#xBC0F; &#xC804;&#xD30C; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC7AC;&#xBC30; &#xB418; &#xACE0;. Protofibrillar &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; &#xACE0; &#xC131;&#xC219;&#xD55C; &#xB179;&#xB9D0; &#xCCB4; &#xC18C; &#xCCB4; &#xC678; &#xAD00;&#xCC30; &#xB41C;&#xB2E4;. &#xC804;&#xCCB4; &#xAE38;&#xC774; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; myocilin &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xC138;&#xD3EC; &#xD615;&#xD0DC; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xC544; &#xBC00; &#xB85C;&#xC774;&#xB4DC; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xC9D1;&#xACC4;&#xB3C4; &#xD45C;&#xD604;. &#xD568;&#xAED8; &#xCC0D;&#xC740;&#xC774; &#xC791;&#xD488;&#xC5D0; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558; &#xACE0; &#xACE0;&#xB3C4;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; OLF &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xBD84;&#xC790; &#xC18D;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC9C8;&#xBB38;&#xC744; &#xC81C;&#xAE30; &#xACE0; &#xC784;&#xC0C1; &#xD658;&#xACBD;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCD94;&#xAC00; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB97C; &#xC704;&#xD574; &#xB179; &#xBCD1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC00;&#xC124;&#xC744; &#xC81C;&#xC548;.

Myocilin&#xC758; &#xB179; &#xB0B4;&#xC7A5; &#xAD00;&#xB828; Olfactomedin &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xB179;&#xB9D0; &#xCCB4; Fibril &#xD615;&#xC131;.

Miocilina es una prote&#xED;na que se encuentra en la matriz extracelular del tejido malla trabecular, la regi&#xF3;n anat&#xF3;mica del ojo implicado en la regulaci&#xF3;n de la presi&#xF3;n intraocular. De tipo salvaje (WT) miocilina se ha asociado con glaucoma inducido por esteroides, y las variantes de miocilina se han vinculado a la aparici&#xF3;n precoz de glaucoma hereditario. Los niveles elevados de agregaci&#xF3;n y de acelerar el aumento de la presi&#xF3;n miocilina intraocular y glaucoma-caracter&#xED;stica de la p&#xE9;rdida de visi&#xF3;n debido a un da&#xF1;o irreversible al nervio &#xF3;ptico. A pesar de los informes sobre la acumulaci&#xF3;n intracelular de mutantes y WT miocilina in vitro, cultivo de c&#xE9;lulas y organismos modelo, estos agregados no se han caracterizado estructuralmente. En este trabajo, nos proporcionan la prueba de las caracter&#xED;sticas biof&#xED;sicas de fibrillas de amiloide en formas agregadas de WT y miocilina mutante localizado en el C-terminal olfactomedin (OLF) de dominio. Estas fibrillas se cultivan bajo una variedad de condiciones en una manera dependiente de la nucleaci&#xF3;n y la auto-reproducci&#xF3;n. Olig&#xF3;meros Protofibrillar y fibrillas de amiloide madura se ha observado in vitro. De longitud completa miocilina mutante se expresa en c&#xE9;lulas de mam&#xED;fero formas intracelulares que contienen amiloide-agregados tambi&#xE9;n. En conjunto, este trabajo proporciona nuevos conocimientos sobre y plantea nuevas preguntas sobre las propiedades moleculares del dominio OLF altamente conservada, y sugiere una novela a base de prote&#xED;nas para la patog&#xE9;nesis del glaucoma hip&#xF3;tesis para su an&#xE1;lisis posterior en un entorno cl&#xED;nico.

Fibrillas amiloides Formaci&#xF3;n por el dominio de Glaucoma-Associated Olfactomedin de miocilina

Cationic monolayer-protected gold nanoparticles (AuNPs) with sizes of 6 or 2 nm interact with the cell membranes of Escherichia coli (Gram-) and Bacillus subtilis (Gram+), resulting in the formation of strikingly distinct AuNP surface aggregation patterns or lysis depending upon the size of the AuNPs. The aggregation phenomena were investigated by transmission electron microscopy and UV-vis spectroscopy. Upon proteolytic treatment of the bacteria, the distinct aggregation patterns disappeared.

Aggregation and interaction of cationic nanoparticles on bacterial surfaces.

&#x4E8C;&#x7EF4; (2D) &#x7684;&#x7ED3;&#x6676;&#x548C;&#x7535;&#x5B50;&#x6676;&#x4F53;&#x5B66;&#x7684;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x4FE1;&#x606F;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x5173;&#x95ED;&#x5230;&#x672C;&#x673A;&#x8102;&#x8D28;&#x53CC;&#x5C42;&#x5185;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x590D;&#x6742;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x6570;&#x91CF;&#x589E;&#x957F;&#x8FC5;&#x901F;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x63D0;&#x4F9B;&#x534F;&#x8BAE;&#x89C4;&#x5212;&#x548C;&#x6267;&#x884C; 2D &#x7ED3;&#x6676;&#x5BA1;&#x5224;&#x7684;&#x6D17;&#x6DA4;&#x5242;&#x53BB;&#x9664;&#x901A;&#x8FC7;&#x900F;&#x6790;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x78F7;&#x8102;&#x548C;&#x900F;&#x6790;&#x5B89;&#x88C5;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x7684;&#x7F16;&#x5199;&#x3002;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x56E0;&#x7D20;&#x6765;&#x8003;&#x8651;&#xFF0C;&#x5982;&#x86CB;&#x767D;&#x5236;&#x5907;&#x3001; &#x589E;&#x6EB6;&#x5242;&#x6D17;&#x6DA4;&#x5242;&#x3001; &#x8102;&#x8D28;&#x91CD;&#x7EC4;&#xFF0C;&#x548C;&#x7F13;&#x51B2;&#x533A;&#x7684;&#x6761;&#x4EF6;&#x8FDB;&#x884C;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x3002;&#x51E0;&#x4E2A; 2D &#x7684;&#x7ED3;&#x6676;&#x6761;&#x4EF6;&#x88AB;&#x7A81;&#x51FA;&#x663E;&#x793A;&#xFF0C;&#x8868;&#x660E;&#x5F88;&#x6709;&#x5E0C;&#x671B;&#x5728;&#x5982;&#x6B64;&#x77ED;&#x7684;&#x65F6;&#x95F4;&#x5185;&#x589E;&#x957F;&#x4E8C;&#x7EF4;&#x6676;&#x4F53;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x6982;&#x8FF0;&#x4E86;&#x4F18;&#x5316;&#x987A;&#x5E8F;&#x548C;&#x5927;&#x5C0F;&#x7684;&#x4E8C;&#x7EF4;&#x6676;&#x4F53;&#x7684;&#x6761;&#x4EF6;&#x3002;

&#x901A;&#x8FC7;&#x91CD;&#x7EC4;&#x901A;&#x8FC7;&#x900F;&#x6790;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x4E8C;&#x7EF4;&#x7ED3;&#x6676;&#x3002;

Studies of membrane proteins by two-dimensional (2D) crystallization and electron crystallography have provided crucial information on the structure and function of a rapidly growing number of these intricate proteins within a close-to-native lipid bilayer. Here we provide protocols for planning and executing 2D crystallization trials by detergent removal through dialysis, including the preparation of phospholipids and the dialysis setup. General factors to be considered, such as the protein preparation, solubilizing detergent, lipid for reconstitution, and buffer conditions are discussed. Several 2D crystallization conditions are highlighted that have shown great promise to grow 2D crystals within a surprisingly short amount of time. Finally, conditions for optimizing order and size of 2D crystals are outlined.

Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis.

&Eacute;tudes des prot&eacute;ines membranaires par cristallographie de cristallisation et &eacute;lectrons bidimensionnel (2D) ont fourni des informations cruciales sur la structure et la fonction d&#39;un nombre rapidement croissant de ces prot&eacute;ines complexes au sein d&#39;une bicouche lipidique de la fin-&agrave;-natif. Ici, nous fournissons des protocoles pour la planification et l&#39;ex&eacute;cution des essais de cristallisation 2D par enl&egrave;vement de d&eacute;tergent par dialyse, y compris la pr&eacute;paration des phospholipides et la configuration de la dialyse. Facteurs g&eacute;n&eacute;raux &agrave; consid&eacute;rer, comme la pr&eacute;paration de la prot&eacute;ine, d&eacute;tergent solubilisant, lipides pour reconstitution des conditions de tampon et on en discute. Plusieurs conditions de cristallisation 2D sont mis en &eacute;vidence qui ont montr&eacute; de grandes promesses &agrave; produire des cristaux 2D dans un d&eacute;lai &eacute;tonnamment court. Enfin, les conditions d&#39;optimisation d&#39;ordre et la taille des cristaux 2D sont d&eacute;crites.

Deux dimensions cristallisation des prot&eacute;ines membranaires par reconstitution par dialyse.

Studien von Membranproteinen durch zweidimensionale (2D) Kristallisation und Elektron-Kristallographie haben wichtige Informationen &uuml;ber die Struktur und Funktion einer rasch wachsenden Zahl dieser komplizierten Proteine innerhalb einer Ende-zu-nativ-Lipid-Bilayer &uuml;bermittelt. Hier bieten wir Protokolle zur Planung und Durchf&uuml;hrung von 2D Kristallisation Studien durch Wasch-und Reinigungsmittel entfernen durch Dialyse, einschlie&szlig;lich der Vorbereitung der Phospholipide und der Dialyse. Allgemeine Faktoren ber&uuml;cksichtigt werden, wie die Protein-Vorbereitung, solubilizing Waschmittel, Lipid Rekonstitution und Puffer Bedingungen diskutiert werden. Mehrere 2D Kristallisation Bedingungen werden hervorgehoben, die viel versprechend zu 2D Kristalle wachsen in &uuml;berraschend kurzer Zeit gezeigt haben. Schlie&szlig;lich sind die Bedingungen f&uuml;r die Optimierung und-Gr&ouml;&szlig;e 2D Kristalle skizziert.

Zweidimensionale Kristallisation von Membranproteinen durch R&uuml;ckverd&uuml;nnung durch Dialyse.

Gli studi delle proteine di membrana da bidimensionale (2D) cristallografia di cristallizzazione ed elettrone hanno fornito informazioni cruciali sulla struttura e sulla funzione di un numero crescente di queste proteine complesse all&#39;interno di un doppio strato lipidico vicino al codice nativo. Qui forniamo protocolli per la pianificazione e l&#39;esecuzione di prove di cristallizzazione 2D da detergente rimozione tramite dialisi, compresa la preparazione di fosfolipidi e l&#39;installazione di dialisi. Generali fattori da considerare, come la preparazione di proteine, detergente solubilizzante, lipidi per la ricostituzione e condizioni di buffer sono discussi. Diverse condizioni di cristallizzazione 2D sono evidenziate che hanno mostrato grande promessa di crescere 2D cristalli entro un lasso di tempo sorprendentemente breve. Infine, sono descritte le condizioni per l&#39;ottimizzazione di ordine e le dimensioni dei cristalli 2D.

Cristallizzazione bidimensionale delle proteine di membrana mediante ricostituzione tramite dialisi.

&#x7814;&#x7A76; 2&#x6B21;&#x5143; (2 D) &#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x3068;&#x96FB;&#x5B50;&#x7DDA;&#x7D50;&#x6676;&#x5B66;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306B;&#x95A2;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x9589;&#x3058;&#x308B;-&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x8102;&#x8CEA;&#x4E8C;&#x5206;&#x5B50;&#x819C;&#x5185;&#x306E;&#x6025;&#x901F;&#x306B;&#x6210;&#x9577;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x6570;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x60C5;&#x5831;&#x304C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x8A08;&#x753B;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x6D17;&#x5264;&#x306E;&#x9664;&#x53BB;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x3068;&#x900F;&#x6790;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x30A2;&#x30C3;&#x30D7;&#x306E;&#x6E96;&#x5099;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x900F;&#x6790;&#x306B;&#x3088;&#x308B; 2&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x8A66;&#x9A13;&#x3092;&#x5B9F;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x6E96;&#x5099;&#x3001;&#x6EB6;&#x89E3;&#x6D17;&#x5264;&#x3001;&#x8102;&#x8CEA;&#x518D;&#x69CB;&#x6210;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30D0;&#x30C3;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x6761;&#x4EF6;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x8003;&#x616E;&#x3059;&#x308B;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x8981;&#x56E0;&#x3002;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E; 2&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x6761;&#x4EF6;&#x306F;&#x3001;&#x9A5A;&#x304F;&#x307B;&#x3069;&#x77ED;&#x6642;&#x9593;&#x5185;&#x3067;&#x306E; 2&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x3092;&#x6210;&#x9577;&#x3059;&#x308B;&#x5049;&#x5927;&#x306A;&#x7D04;&#x675F;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x5F37;&#x8ABF;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;2&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x306E;&#x9806;&#x5E8F;&#x3068;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x3092;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6761;&#x4EF6;&#x306E;&#x3068;&#x304A;&#x308A;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

&#x900F;&#x6790;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x518D;&#x69CB;&#x6210;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x4E8C;&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x3002;

&#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; 2 &#xCC28;&#xC6D0; (2D) &#xACB0;&#xC815; &#xD654; &#xBC0F; &#xC804;&#xC790; &#xACB0;&#xC815;&#xD559;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xAC00;&#xAE4C;&#xC774; &#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xC9C0;&#xC9C8; bilayer &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xAE09;&#xC18D; &#xD558; &#xAC8C; &#xC99D;&#xAC00;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC815;&#xBCF4;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xACC4;&#xD68D; &#xBC0F; &#xD22C; &#xC11D;, &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xD22C; &#xC11D; &#xC124;&#xCE58; &#xC900;&#xBE44; &#xB4F1;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC138;&#xC81C; &#xC81C;&#xAC70; &#xD558; &#xC5EC; 2 &#xCC28;&#xC6D0; &#xACB0;&#xC815; &#xD654; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC2E4;&#xD589;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAC19;&#xC740; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC900;&#xBE44;, solubilizing &#xC138;&#xC81C;, &#xC7AC;&#xAD6C;&#xC131;, &#xBC84;&#xD37C; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC9C0;&#xC9C8;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD558;&#xB294; &#xACE0;&#xB824;&#xD574; &#xC57C; &#xD560; &#xC694;&#xC18C;&#xB97C; &#xC77C;&#xBC18;. &#xC5EC;&#xB7EC; 2D &#xACB0;&#xC815; &#xD654; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0; &#xB180;&#xB77C;&#xC6B8; &#xC815;&#xB3C4;&#xB85C; &#xC9E7;&#xC740; &#xC2DC;&#xAC04; &#xB0B4; 2 &#xCC28;&#xC6D0; &#xACB0;&#xC815; &#xC131;&#xC7A5; &#xC704;&#xB300;&#xD55C; &#xC57D;&#xC18D;&#xC744; &#xAC15;&#xC870; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, 2 &#xCC28;&#xC6D0; &#xACB0;&#xC815;&#xC758; &#xD06C;&#xAE30;&#xC640; &#xC21C;&#xC11C;&#xB97C; &#xCD5C;&#xC801;&#xD654; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xC870;&#xAC74;&#xC740; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xD22C; &#xC11D;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC7AC;&#xAD6C;&#xC131; &#xD558; &#xC5EC; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; 2 &#xCC28;&#xC6D0; &#xACB0;&#xC815; &#xD654;.

Estudios de prote&iacute;nas de membrana de dos dimensiones (2D) Cristalograf&iacute;a de cristalizaci&oacute;n y electr&oacute;nica han proporcionado informaci&oacute;n crucial sobre la estructura y funci&oacute;n de un n&uacute;mero creciente de estas prote&iacute;nas complejas en una bicapa lip&iacute;dica cerrar-a-nativo. Aqu&iacute; le ofrecemos protocolos para la planificaci&oacute;n y ejecuci&oacute;n de ensayos de cristalizaci&oacute;n 2D por extracci&oacute;n del detergente a trav&eacute;s de la di&aacute;lisis, incluida la preparaci&oacute;n de los fosfol&iacute;pidos y la configuraci&oacute;n de la di&aacute;lisis. Factores generales a considerar, tales como la preparaci&oacute;n de la prote&iacute;na, detergente solubilizaci&oacute;n, l&iacute;pidos para la reconstituci&oacute;n y condiciones de b&uacute;fer se discuten. Varias condiciones de cristalizaci&oacute;n 2D destacan que han demostrado gran promesa para crecer cristales 2D en un sorprendentemente corto periodo de tiempo. Finalmente, se detallan las condiciones para optimizar el orden y el tama&ntilde;o de los cristales 2D.

Dos dimensiones cristalizaci&oacute;n de prote&iacute;nas de la membrana por reconstituci&oacute;n a trav&eacute;s de la di&aacute;lisis.

&#x7ED3;&#x6784;&#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x548C;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7535;&#x5B50;&#x6676;&#x4F53;&#x5B66;&#x5305;&#x62EC;&#x51E0;&#x4E2A;&#x5173;&#x952E;&#x6B65;&#x9AA4;&#x3002;&#x4E8C;&#x7EF4; (2D) &#x7ED3;&#x6676;&#x53EF;&#x4EE5;&#x8BF4;&#x662F;&#x53EF;&#x79F0;&#x4E3A;&#x7535;&#x5B50;&#x6676;&#x4F53;&#x5B66;&#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x74F6;&#x9888;&#xFF0C;&#x867D;&#x7136;&#x7528;&#x900F;&#x5C04;&#x7535;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C; (EM) &#x6765;&#x6807;&#x8BC6;&#x4E8C;&#x7EF4;&#x6676;&#x4F53;&#x7B5B;&#x9009;&#x9700;&#x8981;&#x975E;&#x5E38;&#x8C28;&#x614E;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x5B9E;&#x8DF5;&#x3002;&#x6837;&#x54C1;&#x5236;&#x5907;&#x548C; EM &#x662F;&#x6BD4;&#x8F83;&#x5BB9;&#x6613;&#x83B7;&#x5F97;&#xFF0C;&#x76F8;&#x6BD4;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B21;&#x6709;&#x5E8F;&#x9635;&#x5217;&#x7684;&#x9274;&#x5B9A;&#x7684;&#x6280;&#x80FD;&#x3002;&#x6DFB;&#x52A0;&#x5230;&#x6B64;&#xFF0C;&#x819C;&#x53EF;&#x80FD;&#x6709;&#x5404;&#x79CD;&#x5404;&#x6837;&#x7684;&#x5F62;&#x6001;&#x548C;&#x5927;&#x5C0F;&#x3002;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x4E8C;&#x7EF4;&#x6676;&#x4F53;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x6837;&#x672C;&#x7684;&#x7B5B;&#x67E5;&#x4E2D;&#x6240;&#x6D89;&#x53CA;&#x7684;&#x6240;&#x6709;&#x6B65;&#x9AA4;&#x3002;

&#x8D1F;&#x67D3;&#x8272;&#x6837;&#x54C1;&#x7684;&#x900F;&#x5C04;&#x7535;&#x955C;&#x7B5B;&#x67E5;&#x4E8C;&#x7EF4;&#x6676;&#x4F53;&#x3002;

Structural studies of soluble and membrane proteins by electron crystallography include several critical steps. While the two-dimensional (2D) crystallization arguably may be described as the major bottleneck of electron crystallography, the screening by transmission electron microscopy (EM) to identify 2D crystals requires great care as well as practice. Both sample preparation and EM are skills that are relatively easily acquired, compared to the identification of the first ordered arrays. Added to this, membranes may have a variety of morphologies and sizes. Here we describe all steps involved in the screening for 2D crystals as well as the evaluation of samples.

Screening for two-dimensional crystals by transmission electron microscopy of negatively stained samples.

&Eacute;tudes structurales des solubles et les prot&eacute;ines membranaires par cristallographie &eacute;lectronique comprennent plusieurs &eacute;tapes cruciales. Tandis que la cristallisation de la bidimensionnelle (2D) sans doute peut qualifier le goulot d&#39;&eacute;tranglement majeur de cristallographie &eacute;lectronique, l&#39;examen par microscopie &eacute;lectronique &agrave; transmission (EM) pour identifier les cristaux 2D n&eacute;cessite grand soin ainsi que pratique. Pr&eacute;paration des &eacute;chantillons et EM sont tous deux comp&eacute;tences acquises relativement facilement, par rapport &agrave; l&#39;identification des premiers tableaux command&eacute;s. Ajout&eacute; &agrave; cela, les membranes peuvent avoir une vari&eacute;t&eacute; de tailles et morphologies. Nous d&eacute;crivons ici toutes les &eacute;tapes &agrave; suivre pour le d&eacute;pistage des cristaux 2D ainsi que l&#39;&eacute;valuation des &eacute;chantillons.

D&eacute;pistage de cristaux bidimensionnels par microscopie &eacute;lectronique &agrave; transmission d&#39;&eacute;chantillons color&eacute;es n&eacute;gativement.

Strukturelle Studien von l&ouml;slichen und Membranproteine durch Elektronen Kristallographie umfassen mehrere wichtige Schritte. W&auml;hrend die zweidimensionale (2D)-Kristallisation wohl als Engpass der Elektron-Kristallographie bezeichnet werden kann, erfordert das Screening von Transmissionselektronenmikroskopie (EM) zur Identifizierung von 2D Kristalle gro&szlig;er Sorgfalt als auch Praxis. Probenvorbereitung und EM sind F&auml;higkeiten, die relativ leicht erworben werden, im Vergleich zur Identifizierung der ersten bestellten Arrays. Dazu m&uuml;ssen die Membranen verschiedener Gr&ouml;&szlig;en und Morphologien. Hier beschreiben wir alle Schritte, die beim Screening f&uuml;r 2D Kristalle sowie die Auswertung der Proben.

Screening f&uuml;r zweidimensionale Kristalle von Transmissionselektronenmikroskopie negativ gef&auml;rbten Proben.

Studi strutturali di solubili e proteine di membrana di cristallografia elettrone includono diversi passaggi critici. Mentre la cristallizzazione bidimensionale (2D) probabilmente pu&ograve; essere descritto come il collo di bottiglia principale di cristallografia di elettrone, lo screening di microscopia elettronica della trasmissione (EM) per identificare i 2D cristalli richiede grande cura, come pure la pratica. Sia la preparazione del campione ed EM sono abilit&agrave; che sono relativamente facilmente acquisita, rispetto all&#39;identificazione delle matrici ordinate prime. Aggiunto a questo, le membrane possono avere una variet&agrave; di morfologie e dimensioni. Qui descriviamo tutti i passaggi coinvolti nello screening per 2D cristalli, nonch&eacute; la valutazione dei campioni.

Lo screening per cristalli bi-dimensionali di microscopia elettronica della trasmissione dei campioni colorati negativamente.

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2&#x6B21;&#x5143;&#x7D50;&#x6676;&#x306E;&#x900F;&#x904E;&#x578B;&#x96FB;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5426;&#x5B9A;&#x7684;&#x306B;&#x67D3;&#x8272;&#x8A66;&#x6599;&#x306E;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3002;

&#xC6A9; &#xD574;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xBC0F; &#xC804;&#xC790; &#xACB0;&#xC815;&#xD559;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBA87; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. 2 &#xCC28;&#xC6D0; (2D) &#xACB0;&#xC815; &#xD654; &#xD2C0;&#xB9BC; &#xC5C6;&#xC774; &#xC804;&#xC790; &#xACB0;&#xC815;&#xD559;&#xC758; &#xC8FC;&#xC694; &#xBCD1;&#xBAA9; &#xD604;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xC124;&#xBA85; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;, &#xC804;&#xC1A1; &#xC804;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; (EM) 2D &#xD06C;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xD0C8;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558; &#xC5EC; &#xC2EC;&#xC0AC; &#xC5F0;&#xC2B5;&#xC73C;&#xB85C; &#xD070; &#xAD00;&#xC2EC;&#xACFC; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC0D8;&#xD50C; &#xC900;&#xBE44; &#xBC0F; EM&#xC740; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC27D;&#xAC8C; &#xC778;&#xC218;&#xB294; &#xCCAB; &#xBC88;&#xC9F8; &#xC815;&#xB82C; &#xB41C; &#xBC30;&#xC5F4; &#xC2DD;&#xBCC4;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xAE30;&#xC220;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xAC83;&#xC5D0; &#xCD94;&#xAC00;, &#xB9C9; &#xBB38;&#xBC95;&#xACFC; &#xD06C;&#xAE30;&#xC758; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C;&#xC774; &#xC788;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xC0D8;&#xD50C; &#xD3C9;&#xAC00; &#xBC0F; 2D &#xD06C;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xD0C8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC2EC;&#xC0AC;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xB2E8;&#xACC4;&#xB97C; &#xC124;&#xBA85;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

2 &#xCC28;&#xC6D0; &#xACB0;&#xC815;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBD80;&#xC815;&#xC801; &#xC2A4;&#xD14C;&#xC778;&#xB4DC; &#xC0D8;&#xD50C; &#xC804;&#xC1A1; &#xC804;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC0C1;&#xC601;.

Estudios estructurales de solubles y prote&iacute;nas de la membrana por Cristalograf&iacute;a de electr&oacute;n incluyen varios pasos cr&iacute;ticos. Mientras que la cristalizaci&oacute;n (2D) bidimensional podr&iacute;a decirse que puede describirse como el principal cuello de botella de Cristalograf&iacute;a de la electr&oacute;nica, la proyecci&oacute;n por microscop&iacute;a electr&oacute;nica de transmisi&oacute;n (EM) para identificar cristales 2D requiere mucho cuidado, as&iacute; como la pr&aacute;ctica. Preparaci&oacute;n de muestras tanto EM son habilidades que se adquieren relativamente f&aacute;cil, comparado con la identificaci&oacute;n de los primeros arreglos ordenados. Sumado a esto, las membranas pueden tener una variedad de tama&ntilde;os y morfolog&iacute;as. Aqu&iacute; se describen todos los pasos involucrados en la investigaci&oacute;n para cristales 2D, as&iacute; como la evaluaci&oacute;n de las muestras.

Detecci&oacute;n de cristales bidimensionales por microscop&iacute;a electr&oacute;nica de transmisi&oacute;n de muestras negativamente manchadas.

Electron crystallography is emerging as an important method in solving protein structures. While it has found extensive applications in the understanding of membrane protein structure and function at a wide range of resolutions, from revealing oligomeric arrangements to atomic models, electron crystallography has also provided invaluable information on the soluble α/β-tubulin which could not be obtained by any other method to date. Examples of critical insights from selected structures of membrane proteins as well as α/β-tubulin are described here, demonstrating the vast potential of electron crystallography that is first beginning to unfold.

Structure-function insights of membrane and soluble proteins revealed by electron crystallography.

Two-dimensional (2D) crystals of integral membrane proteins, comprising ordered protein reconstituted into a synthetic lipid bilayer, can be induced to form from detergent solubilized and purified membrane protein sources via the addition of exogenous lipid and the subsequent removal of the solubilizing detergent. This is most commonly accomplished by dialysis of a small volume of ternary protein-detergent-lipid mixture against a large volume of buffer, and can be carried out using common, easily available materials. Following successful crystallization, electron crystallographic data obtained by electron cryo-microscopy (cryo-EM) of vitrified 2D crystals can be used to determine the structure of the lipid bilayer-embedded integral membrane protein.

Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography.

Electron cryomicroscopy (cryo-EM) has evolved as a widely used approach to understand a range of structure-function questions, particularly of membrane proteins. Studies by both electron crystallography and single particle analysis have provided a wealth of information on membrane transport proteins. Cryo-EM methods with an emphasis on electron crystallography, which has yielded the most membrane transport protein structural information of any of the cryo-EM techniques, are described here. Two-dimensional crystallization approaches are outlined, as well as advances in cryo-EM specimen preparation, data collection, and image processing. Examples of membrane transport protein structure described serve to illustrate some of the advances in both structural understanding and methods. Further examples outline impressive results that were obtained by a combination of electron crystallography and X-ray crystallography as well as additional complementary methods.

Cryo-EM in the study of membrane transport proteins.

Electron crystallography is an electron cryo-microscopy (cryo-EM) method that is particularly suitable for structure-function studies of small membrane proteins, which are crystallized in two-dimensional (2D) arrays for subsequent cryo-EM data collection and image processing. This approach allows for structural analysis of membrane proteins in a close-to-native, phospholipid bilayer environment. The process of growing 2D crystals from purified membrane proteins by dialysis detergent removal is described in this chapter. A short section covers screening for and identifying 2D crystals by transmission electron microscopy, and in the last section, optimization of the purification to obtain crystals of higher quality is discussed. 

Inducing two-dimensional crystallization of membrane proteins by dialysis for electron crystallography.

During viral RNA synthesis by the viral RNA-dependent RNA polymerase (vRdRp) of vesicular stomatitis virus, the sequestered RNA genome must be released from the nucleocapsid in order to serve as the template. Unveiling the sequestered RNA by interactions of vRdRp proteins, the large subunit (L) and the phosphoprotein (P), with the nucleocapsid protein (N) must not disrupt the nucleocapsid assembly. We noticed that a flexible structural motif composed of an α-helix and a loop in the N protein may act as the access gate to the sequestered RNA. This suggests that local conformational changes in this structural motif may be induced by interactions with the polymerase to unveil the sequestered RNA, without disrupting the nucleocapsid assembly. Mutations of several residues in this structural motif-Glu169, Phe171, and Leu174-to Ala resulted in loss of viral RNA synthesis in a minigenome assay. After implementing these mutations in the viral genome, mutant viruses were recovered by reverse genetics and serial passages. Sequencing the genomes of the mutant viruses revealed that compensatory mutations in L, P, and N were required to restore the viral viability. Corresponding mutations were introduced in L, P, and N, and their complementarity to the N mutations was confirmed by the minigenome assay. Introduction of the corresponding mutations is also sufficient to rescue the mutant viruses. These results suggested that the interplay of the N structural motif with the L protein may play a role in accessing the nucleotide template without disrupting the overall structure of the nucleocapsid. During viral RNA synthesis of a negative-strand RNA virus, the viral RNA-dependent RNA polymerase (vRdRp) must gain access to the sequestered RNA in the nucleocapsid to use it as the template, but at the same time may not disrupt the nucleocapsid assembly. Our structural and mutagenesis studies showed that a flexible structural motif acts as a potential access gate to the sequestered RNA and plays an essential role in viral RNA synthesis. Interactions of this structural motif within the vRdRp may be required for unveiling the sequestered RNA. This mechanism of action allows the sequestered RNA to be released locally without disrupting the overall structure of the nucleocapsid. Since this flexible structural motif is present in the N proteins of many NSVs, release of the sequestered RNA genome by local conformational changes in the N protein may be a general mechanism in NSV viral RNA synthesis.

Complementary Mutations in the N and L Proteins for Restoration of Viral RNA Synthesis.

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a member of the ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily that has uniquely evolved to function as a chloride channel. It binds and hydrolyzes ATP at its nucleotide binding domains to form a pore providing a diffusive pathway within its transmembrane domains. CFTR is the only known protein from the ABC superfamily with channel activity, and its dysfunction causes the disease cystic fibrosis. While much is known about the functional aspects of CFTR, significant gaps remain, such as the structure-function relationship underlying signaling of ATP binding. In the present work, we refined an existing homology model using an intermediate-resolution (9 Å) published cryo-electron microscopy map. The newly derived models have been simulated in equilibrium molecular dynamics simulations for a total of 2.5 μs in multiple ATP-occupancy states. Putative conformational movements connecting ATP binding with pore formation are elucidated and quantified. Additionally, new interdomain interactions between E543, K968, and K1292 have been identified and confirmed experimentally; these interactions may be relevant for signaling ATP binding and hydrolysis to the transmembrane domains and induction of pore opening.

ATP-Dependent Signaling in Simulations of a Revised Model of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR).

The electron cryo-microscopy (cryo-EM) approach of 2D electron crystallography allows for structure determination of two-dimensional (2D) crystals of soluble and membrane proteins, employing identical principles and methods once 2D crystals are obtained. Two-dimensional crystallization trials of membrane proteins can result in multiple outcomes of ordered arrays, which may be suited for either 2D electron crystallography, helical analysis, or MicroED.The membrane protein 2D crystals used for 2D electron crystallography are either single- or double-layered ordered proteoliposome vesicles or sheet-like membranes. We have developed a cryo-EM grid preparation approach, which allows for the analysis of stacked 2D crystals that are neither suitable for MicroED nor for directly applying 2D electron crystallography. This new grid preparation approach, the peel-blot, uses the capillary force generated by submicron filter paper and mechanical means for the separation of stacked 2D crystals into single-layered 2D crystals, for which standard 2D electron crystallography can then be employed. The preparation of 2D crystals, the peel-blot grid preparation, and the structure determination by 2D electron crystallography are described here.

2D Electron Crystallography of Membrane Protein Single-, Double-, and Multi-Layered Ordered Arrays.

Reconstitution of detergent-solubilized membrane proteins into phospholipid bilayers allows for functional and structural studies under close-to-native conditions that greatly support protein stability and function. Here we outline the detailed steps for membrane protein reconstitution to result in proteoliposomes and nanodiscs. Reconstitution can be achieved via a number of different strategies. The protocols for preparation of proteoliposomes use detergent removal via dialysis or via nonpolar polystyrene beads, or a mixture of the two methods. In this chapter, the protocols for nanodiscs apply polystyrene beads only. Proteoliposome preparation methods allow for substantial control of the lipid-to-protein ratio, from minimal amounts of phospholipid to high concentrations, type of phospholipid, and mixtures of phospholipids. In addition, dialysis affords a fairly large degree of control and variation of parameters such as rate of reconstitution, temperature, buffer conditions, and proteoliposome size. For the nanodisc approach, which is highly advantageous for ensuring equal access to both membrane sides of the protein as well as fast reconstitution of only a single membrane protein into a well-defined bilayer environment in each nanodisc, the protocols outline how a number of these parameters are more restricted in comparison to the proteoliposome protocols.

ArticleTotal : 2	Year
Publication title	2010
Publication title	2022

Article	Year
Human leukotriene C(4) synthase at 4.5 A resolution in projection. Structure (London, England : 1993)\| PubMed ID: 15530365	2004
Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent gamma-glutamyl carboxylase. Journal of structural biology\| PubMed ID: 16979907	2007
Electron crystallography of membrane proteins: two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods (San Diego, Calif.)\| PubMed ID: 17367714	2007
Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron (Oxford, England : 1993)\| PubMed ID: 20678942	2011
Amyloid Fibril Formation by the Glaucoma-Associated Olfactomedin Domain of Myocilin. Journal of molecular biology\| PubMed ID: 22197377	2011
Aggregation and interaction of cationic nanoparticles on bacterial surfaces. Journal of the American Chemical Society\| PubMed ID: 22489570	2012
Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)\| PubMed ID: 23132054	2013
Screening for two-dimensional crystals by transmission electron microscopy of negatively stained samples. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)\| PubMed ID: 23132056	2013
Structure-function insights of membrane and soluble proteins revealed by electron crystallography. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)\| PubMed ID: 23132078	2013
Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography. Methods in cell biology\| PubMed ID: 23317909	2013
Cryo-EM in the study of membrane transport proteins. Comprehensive Physiology\| PubMed ID: 23728976	2012
Inducing two-dimensional crystallization of membrane proteins by dialysis for electron crystallography. Methods in enzymology\| PubMed ID: 25950973	2015
Complementary Mutations in the N and L Proteins for Restoration of Viral RNA Synthesis. Journal of virology\| PubMed ID: 30135126	2018
ATP-Dependent Signaling in Simulations of a Revised Model of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR). The journal of physical chemistry. B\| PubMed ID: 30921517	2019
2D Electron Crystallography of Membrane Protein Single-, Double-, and Multi-Layered Ordered Arrays. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)\| PubMed ID: 33368006	2021
Reconstitution of Detergent-Solubilized Membrane Proteins into Proteoliposomes and Nanodiscs for Functional and Structural Studies. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)\| PubMed ID: 33877620	2021

Ingeborg Schmidt-Krey

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