从14日龄的幼苗组织原生质体的分离拟南芥</em

摘要

这个视频展示了从14日龄拟南芥幼苗组织中分离完整的原生质体的过程。此过程加快，原生质体保持不变的至少96小时，是从，而不是一月龄成熟的植物幼苗孤立的，需要完整的原生质体的检测。

摘要

原生质体是植物细胞有细胞壁酶去除的。超过40年前首次报道从不同植物组织的原生质体的分离

研究方案

第1部分。制备固体培养基上生长的植物。

我们通常集中Murasige和Skoog（MS）培养基上的文化植物辅以1％蔗糖和0.7％的琼脂。它包含了所有必要的成分，保持健康的植物。

准备介质pH值5.7的MS，1L

1. 在1.5 - 2.0L高压灭菌瓶，加入到800毫升的水的MS粉2.15克。
2. 放置一个搅拌棒装入瓶中，并解散MS粉搅拌，搅拌板介质。
3. 边搅拌，加，一滴一滴，1N氢氧化钾MS培养基的pH值调整到5.7。
4. 添加10克的蔗糖，不断搅拌。
5. 添加7克，琼脂*
6. 调整的准备介质的最终体积1000毫升，并通过高压灭菌消毒.*
7. 广场蒸压中等搅拌板，边搅拌冷却下来，因此，琼脂不会沉淀在瓶底。降温介质〜60 ° C。
8. 倒入100毫米的Petri板。 '保持在4板° C。

*提示1：不要试图解散琼脂。它会溶解在高压灭菌。
*提示2：保持在高压灭菌过程中瓶中的搅拌棒，​​你会用到它。
*提示3：如果你能保持你的手10秒的灭菌瓶，这意味着中期有足够的冷却下来，你就可以开始浇筑板。

第2部分。植物材料和生长条件。

1. 消毒拟南芥的种子
   1. 的Eppendorf离心管放入种子100毫克，加1毫升70％的乙醇。充分混匀，孵育2分钟。自旋种子，吸出上清液。
   2. 添加1.8％的漂白粉溶液1毫升含0.1％Tween - 20的。混合10分钟。离心种子和吸出的漂白粉溶液。
   3. 这一步要在层流罩。添加1毫升无菌水的种子，拌匀。离心种子，吸​​水。重复此步骤5次。
2. 传播到在步骤1片（100粒种子/盘）准备的种子。
3. 种子板块保持在4 ° 24 - C在暗分层。
4. 种植植物在生长室为14天8小时light/16 h黑暗光照（250μmol米^{-2 s} - 1时光合作用光子通量密度）和75％，23 / 19 ° C光/暗温度政权的相对湿度。

*提示1：漂白溶液稀释一个家喻户晓的Clorox公司，含有6％次氯酸钠和Tween - 20的加入终浓度为0.1％。

第3部分。 拟南芥原生质体的分离。

1. 14日龄的幼苗在15毫升过滤灭菌电视线解决方案的新鲜刀片切片2克。一次性无菌培养皿中，我们砍的植物材料。
2. 切碎组织转移到200毫升烧杯中，加20毫升过滤灭菌的酶液，摇动烧杯，让组织与酶液混合，用封口膜，铝箔盖。
3. 摇植物组织，在黑暗中在35 RPM，在室温为16-18小时
4. 通过8层纱布，在W5的解决方案预湿筛，收集到50毫升猎鹰管释放的原生质体。
5. 筛原生质体经水洗布​​W5的解决方案与15毫升的奶酪布更多的时间。
6. 小心覆盖W5的解决方案与10毫升的原生质体，不干扰糖梯度;离心7分钟100克。
7. 收集在10毫升原生质体的酶液和W5解决方案（图1B）接口，并转移到一个新的50毫升猎鹰管。
8. 添加15毫升W5的解决方案，离心5分钟，在60克去除上清。
9. 在60克resuspending15毫升的W5的解决方案，离心机原生质体原生质体酶液洗5min后
10. 取出上清，悬浮颗粒的原生质体在13毫升W5的解决方案。
11. 评估与血球计数细胞原生质体的产量。

第4部分。试剂：

电视线：0.3 M山梨醇; 50毫米氯化钙₂过滤消毒，并保存在-20 ° C 。

酶溶液：0.5 M的蔗糖，MES - ​​KOH pH值5.7，20毫米10毫米_氯化钙 ，氯化钾40毫米，1％的纤维素酶（Onozuka R - 10），1％Macerozyme（R10） 。过滤，消毒和新鲜使用。

W5的解决方案：0.1％（W / V）葡萄糖，0.08％（W / V）的氯化钾，0.9％（W / V）氯化钠，1.84％（W / V），2毫米的MES KOH pH值5.7 _氯化钙 。过滤，消毒和存放在室温下。

第5部分：代表性的成果：

拟南芥文化1和第2部分中所描述的条件，呈现健康苗，适合于分离原生质体（图1A）。原生质体纯化蔗糖密度梯度耳鼻喉科离心和W5和酶的解决方案（图1B）接口收集。使用第3部分中所描述的原生质体分离过程中，我们通常的收获从一克新鲜^苗 5-10完整的原生质体10 6（图1C）。

图1。拟南芥原生质体的分离 。 ，14日龄拟南芥幼苗组织收集，并转换为原生质体修改的过程（陈和Halkier，2000年），B，原生质体纯化蔗糖密度梯度离心法和酶液界面收集和W5的uffer（ 白色箭头 ），C，原生质体的明场显微镜。显微收集使用冷却CCD相机与蔡司Axioscope 2加显​​微镜接口。

讨论

为了确保完整的原生质体的产量高，它是非常重要的启动与健康的植物。使用过滤消毒隔离原生质体解决方案。记住，原生质体是脆弱的。因此，当你正在处理的原生质体时，不要混用，吸管或涡他们大力，因为这将制动他们。相反，混合，通过缓慢旋转或胶带的离心管中的原生质体。所描述的过程产量完整的原生质体是可行的至少96小时。因此，原生质体，可用于研究各种细胞过程，如蛋白质?...

材料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)		Sigma	M5524
Agar		Sigma	A1296
Petri Dishes (100x15mm)		Kreckeler Scientific	82-4001
Cellulase (Onozuka R‐10)		RPI Corp	C32200
Macerozyme (R10)		RPI Corp	M22010
Cheesecloth wipes		Fisher Scientific	06-665-29
Lab Rotator		Fisher Scientific	1167152Q
Allegra X‐15R Centrifuge		VWR	392932
Axioskop2 Plus Microscope		Zeiss