Isolamento di protoplasti da tessuti di 14-giorni di età piantine di Arabidopsis thaliana</em

Riepilogo

Questo video mostra una procedura per isolare protoplasti intatti da tessuti di 14-giorno-vecchie piantine di Arabidopsis. Dato che il protoplasti isolati rimangono intatte per almeno 96 ore e sono isolati da piantine invece di piante mature di un mese-vecchia, questa procedura accelera i test che richiedono protoplasti intatti.

Abstract

Protoplasti sono cellule vegetali che hanno avuto le loro pareti cellulari enzimaticamente rimosso. Isolamento di protoplasti dai tessuti vegetali diversi per la prima volta segnalato più di 40 anni fa

Protocollo

Parte 1. Preparazione del terreno solido per le piante in crescita.

Noi di solito le piante sulla cultura concentrato Murasige e Skoog (MS) media integrato con 1% di saccarosio e lo 0,7% agar. Esso contiene tutti gli ingredienti necessari per mantenere le piante sane.

Per preparare 1L di MS, media pH 5,7

1. Aggiungere 2,15 g di MS polvere in 800 ml di acqua in bottiglia da 1,5 2.0L autoclavabile.
2. Posizionare un bar mescolando nella bottiglia e si dissolvono in polvere MS agitando medio su un piatto mescolando.
3. Mescolando, aggiungere, goccia a goccia, KOH 1N per aggiustare il pH medio di MS a 5,7.
4. Aggiungere 10 g di saccarosio, continuare a mescolare.
5. Aggiungono 7 g di agar *.
6. Regolare il volume finale del terreno preparato a 1000 ml e sterilizzare in autoclave .*
7. Luogo autoclave medio su un piatto mescolando e raffreddarlo mescolando, in modo che agar non precipitare sul fondo della bottiglia. Raffreddare medio ~ 60 ° C. *
8. Versare 100 millimetri piastre Petri. Tenere le piastre a 4 ° C.

* Suggerimento 1: Non tentare di sciogliere agar. Si solubilizzano durante la sterilizzazione in autoclave.
* Suggerimento 2: Tenere la barra mescolando in una bottiglia durante la sterilizzazione, ne avrete bisogno in seguito.
* Suggerimento 3: Se potete tenervi le mani sulla bottiglia in autoclave per 10 s, significa che il mezzo si raffreddi e si può cominciare a diffondere piatti.

Parte 2. Materiale vegetale e condizioni di crescita.

1. Sterilizzare i semi di Arabidopsis thaliana
   1. Mettere 100 mg di semi in provette da microcentrifuga eppendorf e aggiungere 1 ml di etanolo al 70%. Mescolare bene e incubare per 2 minuti. Spin semi giù, aspirare il sopranatante.
   2. Aggiungere 1 ml di soluzione di candeggina al 1,8% * contenente 0,1% di Tween-20. Mescolare per 10 min. Spin down semi e soluzione di candeggina aspirare.
   3. Questo passo deve essere fatto in una cappa a flusso laminare. Aggiungere 1 ml di acqua sterile per i semi, mescolare bene. Spin down semi, aspirare l'acqua. Ripetere questa operazione per 5 volte.
2. Diffondere i semi sul preparato nella fase 1 piastre (100 semi / piastra).
3. Conservare le piastre seminate per 24-48 ore a 4 ° C al buio per la stratificazione.
4. Coltivare piante per 14 giorni nella camera di crescita con 8 h light/16 h scuro fotoperiodo (con una densità di fotosintesi flusso di fotoni di 250 mmol m ^-2 s ^-1) a 23 / ​​19 ° C, luce / buio regime di temperatura e il 75% rispetto umidità.

* Suggerimento 1: soluzione di Bleach è composto da una famiglia di diluizione Clorox, contenente ipoclorito di sodio al 6% e l'aggiunta di Tween-20 a una concentrazione finale di 0,1%.

Parte 3. Isolamento di protoplasti da piantine di Arabidopsis.

1. Fetta 2 g di 14-giorno-vecchio piantine con una lama di rasoio fresco in 15 ml di soluzione sterilizzata per filtrazione, TVL. Noi tagliare materiale vegetale in piatti monouso sterili Petri.
2. Trasferimento tessuti tagliati in 200 ml bicchiere, aggiungere 20 ml di soluzione enzimatica, sterilizzata per filtrazione, agitare il bicchiere per far mescolare tessuti con soluzione enzimatica, coprire con parafilm e foglio di alluminio.
3. Agitare tessuti vegetali a 35 giri al buio a temperatura ambiente per 16-18 h.
4. Raccogliere la protoplasti rilasciata nel tubo da 50 ml Falcon mediante setacciatura a 8 strati di telo, pre-umido in W5 soluzione.
5. Protoplasti setaccio dal formaggio panno ancora una volta con il lavaggio il panno con 15 ml di soluzione W5.
6. Attentamente protoplasti sovrapposizione con 10 ml di soluzione W5, non disturbare il gradiente di zucchero; centrifugare per 7 minuti a 100 g.
7. Raccogliere 10 ml di protoplasti a livello di interfaccia di soluzione enzimatica e W5 Soluzione (Fig. 1B) e trasferirli in un nuovo tubo da 50 ml Falcon.
8. Aggiungere 15 ml di soluzione W5, centrifugare per 5 min a 60 g. Rimuovere il surnatante.
9. Lavare protoplasti privi di soluzione enzimatica da risospendere protoplasti in 15ml di soluzione W5, centrifugare per 5 min a 60 g
10. Rimuovere il surnatante, risospendere protoplasti pellet in 1-3ml W5 soluzione.
11. Valutare resa protoplasti da cellule contando con un emocitometro.

Parte 4. Reagenti:

TVL: 0,3 M sorbitolo; 50 mM CaCl ₂ Filtro-sterilizzare e conservare a -20 ° C.

Enzima Soluzione: 0,5 M saccarosio, 10 mM MES-KOH [pH 5,7], 20 mM CaCl _2, 40 mM KCl, 1% Cellulase (Onozuka R-10), 1% Macerozyme (R10). Filtro-sterilizzare e appena uso.

W5 Soluzione: 0,1% (w / v) di glucosio, 0,08% (w / v) KCl, 0,9% (w / v) di NaCl, 1,84% (w / v) CaCl _{2, 2} mM MES-KOH pH 5.7. Filtro-sterilizzare e conservare a temperatura ambiente.

Parte 5: Risultati Rappresentante:

Utilizzando condizioni di coltura Arabidopsis descritti nelle parti 1 e 2 piantine rende sani, adatti per isolare protoplasti (Fig. 1A). Protoplasti sono purificati dai gradienti di densità di saccarosioENT centrifugazione e raccolti a livello di interfaccia di W5 e soluzioni di enzimi (Fig. 1B). Utilizzando l'isolamento di protoplasti procedura descritta nella parte 3 abbiamo raccolto tipicamente 5-10 ottobre ⁶ di protoplasti intatti (Fig. 1C) da un grammo di piantine fresche.

Figura 1. Isolamento di protoplasti da piantine di Arabidopsis. A, tessuti dal 14-giorni di età piantine di Arabidopsis sono stati raccolti e convertiti in protoplasti con una procedura modificata (Chen e Halkier, 2000). B, protoplasti sono stati purificati mediante centrifugazione gradiente di densità di saccarosio e raccolti a livello di interfaccia della soluzione enzimatica e W5 Uffer (frecce bianche). C, luminoso-campo della microscopia protoplasti. Microfotografie sono stati raccolti utilizzando una camera CCD raffreddata interfacciato con il Axioscope Zeiss 2 plus microscopio.

Discussione

Per garantire l'alto rendimento di protoplasti intatti, è molto importante per start-up con piante sane. Utilizzare un filtro-sterilizzare le soluzioni per l'isolamento protoplasti. Ricordate che protoplasti sono fragili. Pertanto, quando si sono movimentazione protoplasti, non si mescolano, o vortice pipettare vigorosamente perché li freni. Invece, mescolare protoplasti lentamente ruotando o con nastro adesivo il tubo di centrifuga. La procedura descritta protoplasti resa intatta che sono vitali per almeno 96...

Materiali

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)		Sigma	M5524
Agar		Sigma	A1296
Petri Dishes (100x15mm)		Kreckeler Scientific	82-4001
Cellulase (Onozuka R‐10)		RPI Corp	C32200
Macerozyme (R10)		RPI Corp	M22010
Cheesecloth wipes		Fisher Scientific	06-665-29
Lab Rotator		Fisher Scientific	1167152Q
Allegra X‐15R Centrifuge		VWR	392932
Axioskop2 Plus Microscope		Zeiss