Isolamento de Protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis thaliana</em

Resumo

Este vídeo mostra um procedimento para isolar protoplastos intactos a partir de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis. Dado que o protoplastos isolados permanecem intactos por pelo menos 96h e são isoladas de mudas, em vez de um mês de idade plantas maduras, esse procedimento agiliza ensaios exigindo protoplastos intactos.

Resumo

Protoplastos são células vegetais que tiveram suas paredes celulares enzimaticamente removido. Isolamento de protoplastos a partir de tecidos diferentes de plantas foi relatada pela primeira vez mais de 40 anos atrás

Protocolo

Parte 1. Preparação de meio sólido para o crescimento das plantas.

Normalmente, as plantas de cultura concentrada Murasige e Skoog (MS) suplementado com 1% de sacarose e ágar 0,7%. Ele contém todos os ingredientes necessários para manter as plantas saudáveis.

Para preparar 1L de MS, pH 5,7 mídia

1. Adicionar 2,15 g de MS pó em 800 ml de água em 1,5 2.0L garrafa autoclavável.
2. Colocar uma barra de agitação dentro da garrafa e dissolver o pó MS por meio de agitação médio em uma placa de agitação.
3. Agitando, adicione, gota a gota, KOH 1N para ajustar o pH do meio MS para 5,7.
4. Adicionar 10 g de sacarose, continue a mexer.
5. Adicionar 7 g de ágar *.
6. Ajustar o volume final do meio preparado para 1000 ml e esterilizar em autoclave .*
7. Lugar autoclavado médio em uma placa de agitação e esfriá-la, agitando, de modo que agar não irá precipitar no fundo da garrafa. Arrefecer médio a ~ 60 ° C. *
8. Colocar 100 milímetros placas de Petri. Manter placas a 4 ° C.

* Dica 1: Não tente dissolver agar. Ele irá solubilizar durante autoclavagem.
* Dica 2: Manter a barra de agitação em uma garrafa durante a autoclavagem, você vai precisar dele mais tarde.
* Dica 3: Se você pode manter suas mãos no frasco autoclavado por 10 s, isso significa que o meio esfriou o suficiente e você pode começar a verter placas.

Parte 2. Material vegetal e as condições de crescimento.

1. Esterilizar sementes de Arabidopsis thaliana
   1. Coloque 100 mg de sementes em tubos de microcentrífuga eppendorf e adicionar 1 ml de etanol 70%. Misturar bem e incubar por 2 min. Spin-baixo sementes, aspirar o sobrenadante.
   2. Adicionar 1 ml de solução de água sanitária 1,8% * contendo 0,1% Tween-20. Misture por 10 min. Spin down sementes e solução de água sanitária aspirar.
   3. Este passo tem que ser feito em uma capela de fluxo laminar. Adicionar 1 ml de água estéril para sementes, misture bem. Spin down sementes, aspirar água. Repita este passo 5 vezes.
2. Espalhar sementes para o preparado na etapa 1 placas (100 sementes / placa).
3. Manter placas semeadas por 24-48 horas a 4 ° C no escuro por estratificação.
4. Crescer as plantas por 14 dias na câmara de crescimento com 8 h light/16 h escuro fotoperíodo (a uma densidade de fluxo de fótons fotossinteticamente ativos de 250 mmol m ^-2 s ^-1) em 23 / ​​19 ° C de temperatura regime de claro / escuro e relativa de 75% umidade.

* Dica 1: solução de água sanitária é feita por diluição-up uma casa Clorox, contendo hipoclorito de sódio 6% e adição de Tween-20 a uma concentração final de 0,1%.

Parte 3. Isolamento de protoplastos a partir de mudas de Arabidopsis.

1. Slice 2 g de 14 dias de idade, mudas com uma lâmina de barbear fresco em 15 ml de solução esterilizada por filtração, TVL. Nós dividimos o material vegetal em pratos descartáveis ​​estéreis Petri.
2. Transferência de tecidos cortados em 200 ml copo, adicione 20 ml de solução enzimática, esterilizada por filtração, redemoinho o copo para que os tecidos se misturam com solução enzimática, cubra com parafilme e papel alumínio.
3. Agite tecidos da planta em 35 rpm, no escuro em temperatura ambiente por 16-18 h.
4. Recolher os protoplastos liberados em 50 tubos Falcon ml por peneiramento a 8 camadas de pano de queijo, pré-molhada em solução W5.
5. Protoplastos peneira do queijo de pano mais uma vez, lavando o pano com 15 ml de solução W5.
6. Cuidadosamente protoplastos overlay com 10 ml de solução W5, não perturbem o gradiente de açúcar; centrífuga por 7 min a 100 g.
7. Coletar 10 ml de protoplastos na interface da solução enzimática e solução W5 (Figura 1B) e transferir para um novo tubo de 50 ml Falcon.
8. Adicionar 15 ml da solução W5, centrifugar por 5 min a 60 g. Remover o sobrenadante.
9. Lavar protoplastos livre de solução enzimática pela ressuspensão de protoplastos em 15ml de solução W5 centrífuga, por 5min a 60 g
10. Remover o sobrenadante, ressuspender protoplastos peletizada em 1-3ml solução W5.
11. Avaliar o rendimento de protoplastos por célula contando com um hemocitômetro.

Parte 4. Reagentes:

TVL: 0,3 M sorbitol; 50 mM CaCl ₂ Filter-esterilizar e armazenar a -20 ° C.

Solução da enzima: 0,5 M de sacarose, 10 mM MES-KOH [pH 5,7], 20 mM CaCl _2, 40 mM KCl, celulase 1% (Onozuka R-10), Macerozyme 1% (R10). Filtro de esterilizar e recém-uso.

W5 Solução: 0,1% (w / v) de glicose, 0,08% (w / v) KCl, 0,9% (w / v) de NaCl, 1,84% (w / v) CaCl _2, 2 mM MES-KOH pH 5.7. Filtro de esterilizar e armazenar à temperatura ambiente.

Parte 5: Resultados Representante:

Usando condições de cultura Arabidopsis descrito nas partes 1 e 2 torna mudas sadias, servem para isolar protoplastos (Fig. 1A). Protoplastos são purificados pelo sacarose densidade Gradicentrifugação ent e recolhidos na interface da W5 e soluções de enzimas (Figura 1B). Usando o procedimento de protoplastos de isolamento descritas na Parte 3, tipicamente colheita outubro 05-10 ⁶ de protoplastos intactos (Fig. 1C) de um grama de mudas frescas.

Figura 1. Isolamento de protoplastos a partir de mudas de Arabidopsis. A, tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis foram coletados e convertidos em protoplastos através de um procedimento modificado de (Chen e Halkier, 2000). B, Protoplastos foram purificadas por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose e recolhidos na interface da solução de enzima e W5 uffer (setas brancas). C, Bright microscopia de campo de protoplastos. Microfotografias foram coletados por meio de uma câmera CCD refrigerado interface com o Axioscope Zeiss 2 mais microscópio.

Discussão

Para garantir o alto rendimento de protoplastos intactos é muito importante para start-up com as plantas saudáveis. Use filtro esterilizar soluções para isolar protoplastos. Lembre-se que protoplastos são frágeis. Portanto, quando você está lidando com protoplastos, não se misturam, pipeta ou vortex-os vigorosamente, uma vez que vai de freio-los. Em vez disso, misture protoplastos girando lentamente ou com fita do tubo de centrifugação. O procedimento descrito rendimento de protoplastos intactos que são viá...

Materiais

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)		Sigma	M5524
Agar		Sigma	A1296
Petri Dishes (100x15mm)		Kreckeler Scientific	82-4001
Cellulase (Onozuka R‐10)		RPI Corp	C32200
Macerozyme (R10)		RPI Corp	M22010
Cheesecloth wipes		Fisher Scientific	06-665-29
Lab Rotator		Fisher Scientific	1167152Q
Allegra X‐15R Centrifuge		VWR	392932
Axioskop2 Plus Microscope		Zeiss