Выделение протопластов из тканей 14-дневных Рассаду Arabidopsis thaliana</em

Резюме

Это видео показывает процедуру выделения нетронутыми протопластов из тканей 14-дневных проростков арабидопсиса. Учитывая, что изолированных протопластов остаются неизменными, по крайней мере 96 ч и изолированы от саженцев, а не один-месячного взрослых растений, эта процедура ускоряет анализов требует нетронутыми протопластов.

Аннотация

Протопласты растительных клеток, которые имели их клеточных стенок ферментативно удалены. Выделение протопластов из различных растительных тканях впервые сообщили о более чем 40 лет назад

протокол

Часть 1. Подготовка твердой среде для выращивания растений.

Как правило, мы культура растений на сосредоточена Murasige и Скуга (MS) среде с добавлением 1% сахарозы и 0,7% агара. Он содержит все необходимые ингредиенты сохранить растения здоровыми.

Для приготовления 1 л MS, СМИ рН 5,7

1. Добавить 2,15 г MS порошка в 800 мл воды в 1,5-2.0L автоклавируемый бутылку.
2. Место мешалкой в ​​бутылку и растворить порошок MS перемешиванием среды на перемешивание пластины.
3. При перемешивании, добавлять по капле, 1н KOH для регулировки рН среды MS до 5,7.
4. Добавьте 10 г сахарозы, продолжайте перемешивание.
5. Добавить 7 г агар *.
6. Отрегулируйте конечного объема готовой среды до 1000 мл и стерилизуют в автоклаве .*
7. Место автоклавного среды на перемешивание тарелку и охладить при помешивании, чтобы агар не будет осадка на дне бутылки. Охладить среднего ~ 60 ° C. *
8. Залить 100 мм чашки Петри. Храните пластины при температуре 4 ° C.

* Совет 1: Не пытайтесь растворить агар. Это будет растворить в автоклаве.
* Совет 2: Хранить мешалкой в ​​бутылки во время автоклавирования, вы будете нуждаться в этом позже.
* Совет 3: Если Вы можете держать вас в руках бутылка автоклаве в течение 10 с, то это означает, что среда имеет достаточно остыла, и вы можете начать заливки плит.

Часть 2. Растительного материала и условий роста.

1. Стерилизовать семена Arabidopsis thaliana
   1. Разместить 100 мг семян в пробирки Эппендорф микроцентрифужных и добавьте 1 мл 70% этанола. Хорошо перемешать и выдержать в течение 2 мин. Спиновые семена вниз, аспирация супернатант.
   2. Добавить 1 мл 1,8% раствор хлорки *, содержащий 0,1% Твин-20. Смешайте в течение 10 мин. Спином вниз семена и аспирации отбеливающим раствором.
   3. Этот шаг нужно сделать в ламинарном боксе. Добавьте 1 мл стерильной воды для семян, хорошо перемешать. Спином вниз семена, аспирация воды. Повторите этот шаг в 5 раз.
2. Распространение семян на подготовленную на шаге 1 пластинами (100 семян / пластины).
3. Держите посеяны пластин в течение 24-48 ч при 4 ° С в темноте в течение стратификации.
4. Выращивать растения в течение 14 дней в ростовой камере с 8 ч light/16 ч темно фотопериода (на фотосинтетический плотность потока фотонов в 250 мкмоль м ^-2 с ^-1) при 23 / ​​19 ° C светлый / темный температурного режима и 75% относительной влажность.

* Совет 1: Bleach решение выдуманные путем разбавления бытовых Clorox, содержащий 6% гипохлоритом натрия и добавлением твин-20 до конечной концентрации 0,1%.

Часть 3. Выделение протопластов из Arabidopsis саженцев.

1. Фрагмент 2 г 14-дневных проростков со свежим лезвием в 15 мл фильтр-стерилизовать ТВЛ решение. Мы нарезать растительного материала в стерильные одноразовые чашки Петри.
2. Передача нарезанной ткани в 200 мл стакан, добавить 20 мл фильтр-стерилизовать раствор фермента, вихрем стакан, чтобы смешать с тканями раствора фермента, накрыть парафильмом и алюминиевой фольги.
3. Встряхните растительных тканей на 35 мин в темноте при комнатной температуре в течение 16-18 ч.
4. Сбор выпущен протопластов в 50 мл трубки Сокол путем просеивания через 8 слоев сыра тканью, предварительно мокрые в W5 решение.
5. Сито протопластов из сыра тканью еще раз промывкой ткани с 15 мл W5 решение.
6. Тщательно наложения протопластов с 10 мл W5 решение, не мешайте сахар градиента; центрифуги в течение 7 минут при температуре 100 г.
7. Соберите 10 мл протопластов на стыке решения ферментов и W5 Решение (рис. 1б) и переход к новой трубки 50 мл Falcon.
8. Добавьте 15 мл W5 Solution, центрифуги в течение 5 мин при 60 g. Удалить супернатант.
9. Вымойте протопластов свободным от Фермент Решение ресуспендированием протопластов в 15 мл W5 Solution, центрифуга для 5 мин при 60 г
10. Удалить супернатант, ресуспендируют гранулированный протопластов в 1-3 мл W5 решение.
11. Оценка протопластов выходом подсчета клеток с гемоцитометра.

Часть 4. Реагенты:

ТВЛ: 0,3 М сорбит; 50 мМ CaCl ₂ Фильтр-стерилизовать и хранить при температуре -20 ° C.

Фермент Решение: 0,5 М сахарозы, 10 мМ MES-КОН [рН 5,7], 20 мМ CaCl _2, 40 мМ KCl, 1% Целлюлаза (Onozuka R-10), 1% Macerozyme (R10). Фильтр-стерилизовать и недавно использования.

W5 Решение: 0,1% (м / о) глюкозы, 0,08% (м / о) KCl, 0,9% (м / о) NaCl, 1,84% (м / о) CaCl _2, 2 мМ MES-КОН рН 5,7. Фильтр-стерилизовать и хранить при комнатной температуре.

Часть 5: Представитель Результаты:

Использование Arabidopsis условиях культуры описанные в частях 1 и 2 оказывает здорового посадочного материала, пригодного для изоляции протопластов (рис. 1А). Протопластов очищают градиентом плотности сахарозыцентрифугирования ЛОР и собранные на стыке W5 и ферментов решений (рис. 1б). Использование протопластов изоляции процедуре, описанной в части 3 мы обычно урожай 5-10 10 ⁶ интактных протопластов (рис. 1C) из одного грамма свежей рассады.

Рисунок 1. Выделение протопластов из Arabidopsis саженцев. , Тканей из 14-дневных проростков арабидопсиса были собраны и преобразованы в протопластов на изменение процедуры (Chen и Halkier, 2000). B, протопластов очищали сахарозы центрифугирования в градиенте плотности и собранные на границе раствора фермента и W5 uffer (белые стрелки). C, светлая микроскопии протопластов. Микрофотографии были собраны, используя охлаждением ПЗС-камеры с интерфейсом Axioscope Zeiss 2 плюс микроскопом.

Обсуждение

Для обеспечения высокого выхода интактных протопластов это очень важно для запуска со здоровыми растениями. Использовать фильтр-стерилизовать решения для выделения протопластов. Помните, что протопласты хрупкой. Поэтому, когда вы обращаетесь протопластов, не смешиваются, пипетки ил?...

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)		Sigma	M5524
Agar		Sigma	A1296
Petri Dishes (100x15mm)		Kreckeler Scientific	82-4001
Cellulase (Onozuka R‐10)		RPI Corp	C32200
Macerozyme (R10)		RPI Corp	M22010
Cheesecloth wipes		Fisher Scientific	06-665-29
Lab Rotator		Fisher Scientific	1167152Q
Allegra X‐15R Centrifuge		VWR	392932
Axioskop2 Plus Microscope		Zeiss