牛痘病毒感染及病毒基因表达的时空分析：第3部分

摘要

协议牛痘感染的HeLa细胞和宿主和病毒基因的表达分析。第3部分介绍了从主机和染料的氨基烯丙基耦合病毒样本的荧光标记扩增的RNA的过程。

摘要

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研究方案

第1部分：ARNA标签：染料的氨基烯丙基耦合

1. 添加到1.5ml离心管ARNA样品1μg。
2. ，直到它们完全干燥，真空干燥的样品低或无热量。第每个管，只要它是干的-不 overdry！
3. 每管加入9μl耦合缓冲和重悬轻轻振荡1分钟的ARNA。短暂离心收集样品在试管底部，然后让样品坐冰。
4. 加入22μl高品质二甲基亚砜每个管Cy3或Cy5的染料。染料管够2个样品。 Cy3标记的染料为您的参考样本标签，标签测试样品和Cy5的染料。
5. 涡染料调匀。在黑暗中保持，直到准备使用的染料。不要前的准备使用的染料早1个多小时。确保没有水混合染料/ DMSO在任何时候获取。
6. 每个样品准备二甲基亚砜/ CY染料添加11μl。涡旋轻轻拌匀。
7. 孵育室温为30-45分钟。用锡纸盖的样品或保持在一个抽屉里，以尽量减少暴露在光线下。
8. 孵化后，每个样品中加入4.5μlhydroxlyamine淬火反应。涡旋轻轻拌匀。
9. 孵育15分钟在室温。用锡纸盖的样品或保持在一个抽屉里，以尽量减少暴露在光线下。

第2部分：标记ARNA清理

1. 旋涡RNA结合珠简要地获取，使用前均匀混合。
2. 准备ARNA绑定混合，在室温下（见表1 ）。
3. 由涡旋混合。
4. 成1.5ml离心管，并在50-60℃孵育至少10分钟Aliquote ARNA洗脱缓冲液。
5. 每个样品添加ARNA约束力混合70μl，拌匀移液器向上和向下的3-4倍。
6. 样品PCR板转移到一个96孔的圆底板。
7. 100％异丙醇每个样品中加入50μL拌匀移液器向上和向下的3-4倍。
8. 轻轻摇动至少2分钟，轨道摇床板，彻底混合样品。
9. 移动板磁性的立场，以捕获磁珠。离开盘上的立场，直到混合物变得透明和约束力珠颗粒。
10. 小心吸上清液真空抽吸，而不会干扰磁珠。另外，用移液器小心取出上清，弃上清。上清应该是明亮的粉红色，或在这一点上，由于非法团的染料分子的明亮的蓝色。
11. 删除从磁立场板。
12. 加入100μLARNA每口井的清洗液，摇动1分钟，速度适中的轨道摇床板。珠可能无法完全分散在这一步。
13. 移动板磁性的立场，以捕获磁珠。
14. 小心吸上清液真空抽吸，而不会干扰磁珠。另外，用移液器小心取出上清，弃上清。
15. 删除从磁立场板。
16. 重复100μLARNA清洗液洗了^第二 。
17. 之后的第2 ^次洗，干燥摇晃以最快的速度为1分钟的轨道摇床板的珠子。不要overdry的样品！
18. 每个样品加入20μL预热ARNA洗脱液洗脱珠ARNA。
19. 大力动摇盘3分钟轨道摇床，然后检查，以确保磁珠完全散去。如果没有，继续摇晃。
20. 一旦磁珠完全散去，移动板磁性的立场，以捕获磁珠。上清包含清理，标记ARNA样本，而应该是一个淡粉色或淡蓝色。
21. 洗脱ARNA小心地转移到一个新的PCR板（或PCR管）。
22. （可选步骤）检查所使用芯片模块上的一个NanoDrop分光光度计测量1.5μl的样品中的RNA浓度和染料用量。
23. 立即到您所选择的芯片平台的杂交标记ARNA，或者，您可以标记ARNA储存于-80 ° C，直到你准备进行杂交。

表1绑定混合ARNA

试剂	金额为1反应
核糖核酸*装订珠	加入10μl
珠再悬浮解决方案*	4μl
100％的异丙醇**	6μl
ARNA绑定缓冲液	50μL

*与RNA结合珠的混合珠再悬浮的解决方案第一
**添加异丙醇和拌匀之前加入ARNA结合缓冲液。

讨论

关键步骤

执行氨基烯丙基耦合时，关键是重悬在二甲基亚砜在短期内（少于1小时）前耦合的染料，并确保没有水进入染料/ DMSO混合，因为它会与染料的活性基团反应。不要overdry RNA（可干1 2uL，而不是完全干燥），以及在耦合缓冲液重悬。在偶联反应过程中，不断在黑暗中的反应，偶尔弹和自旋向下，如果需要。

应用程序/意义

人类，病?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack	Reagent	GE Healthcare	RPN5661	Contains both Cy3 and Cy5 dyes
NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer	Other	NanoDrop	ND-1000	Or equivalent spectrophotometer