Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 3

Riepilogo

Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 3 descrive il processo di fluorescenza etichettatura RNA amplificato da entrambi host e campioni di virus da aminoacidi accoppiamento allilico di coloranti. Parte 3 di 3.

Abstract

La famiglia

Protocollo

Parte 1: ARNA etichettatura: accoppiamento allilico amino dei coloranti

1. Aggiungere 1μg dei campioni ARNA in provette da microcentrifuga 1,5 ml.
2. Vuoto a secco i campioni a fuoco basso o nullo fino a quando non sono completamente asciutti. Cap ciascun tubo non appena è asciutto - non asciugare eccessivamente!
3. Aggiungi 9μl buffer di accoppiamento a ciascuna provetta e la ARNA delicatamente su vortex per 1 minuto. Centrifugare brevemente per raccogliere il campione sul fondo del tubo, e poi lasciare che il campione sedersi sul ghiaccio.
4. Aggiungere 22μl di DMSO di alta qualità per ogni tubo di Cy3 o Cy5 colorante. Un tubo di colorante è sufficiente per 2 campioni. Il colorante è Cy3 per etichettare i campioni di riferimento, e il colorante Cy5 è per etichettare i campioni di prova.
5. Vortex le tinture per mescolare completamente. Mantenere i coloranti al buio fino al momento dell'uso. Non preparare colorante prima di 1 ora prima dell'uso. Assicurarsi che l'acqua non arriva in tinta / DMSO mix in qualsiasi momento.
6. Aggiungere 11μl del preparato DMSO / Cy colorante per ogni campione. Mescolare bene nel vortex con delicatezza.
7. Incubare per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Coprire con carta stagnola o tenerli in un cassetto per minimizzare l'esposizione alla luce.
8. Dopo l'incubazione, aggiungere 4.5μl hydroxlyamine ad ogni campione di spegnere la reazione. Mescolare bene nel vortex con delicatezza.
9. Incubare per altri 15 minuti a temperatura ambiente. Coprire con carta stagnola o tenerli in un cassetto per minimizzare l'esposizione alla luce.

Parte 2: Labeled ARNA clean-up

1. Vortex le perline RNA vincolante per breve tempo ad ottenere un impasto omogeneo prima dell'uso.
2. Preparare il Mix Binding ARNA a temperatura ambiente. (Tabella 1)
3. Mescolare bene nel vortex.
4. Aliquote Buffer ARNA eluizione in una provetta 1,5 ml ed incubare a 50-60 ° C per almeno 10 minuti.
5. Aggiungere 70μl della miscela ARNA vincolante per ogni campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte.
6. Trasferimento dei campioni dalla piastra PCR ad un 96-ben a fondo rotondo piatto.
7. Aggiungere 50μl del 100% di isopropanolo a ciascun campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte.
8. Agitare delicatamente la piastra su un agitatore orbitale per almeno 2 minuti per mescolare completamente i campioni.
9. Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Lascia la piastra sul supporto fino a quando il composto diventa trasparente e le palline sono vincolanti pellet.
10. Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. Il sopranatante deve essere un rosa brillante o un blu brillante a questo punto a causa della molecole di colorante senza personalità giuridica.
11. Togliere la placca dal supporto magnetico.
12. Aggiungere 100μl soluzione di lavaggio ARNA in ogni pozzetto e agitare la piastra per 1 minuto l'agitatore orbitale a velocità moderata. Perline potrebbero non disperdere in questa fase.
13. Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche.
14. Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante.
15. Togliere la placca dal supporto magnetico.
16. Ripetere il lavaggio per volta 2 ^° con la soluzione di 100μl Wash ARNA.
17. Dopo il 2 ^° lavare, asciugare le perle agitando la piastra per 1 minuto l'agitatore orbitale alla massima velocità. Non asciugare eccessivamente i campioni!
18. Eluire la ARNA dalle perle con l'aggiunta di 20μl preriscaldato Elution Buffer ARNA per ogni campione.
19. Agitare vigorosamente la piastra l'agitatore orbitale per 3 minuti, quindi controllare per assicurarsi che le sfere magnetiche sono completamente disperse. In caso contrario, continuare a tremare.
20. Una volta che il sfere magnetiche sono completamente dispersi, spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Il supernatante contiene il pulito, campioni ARNA etichettati, e dovrebbe essere un rosa pallido o di un azzurro pallido.
21. Trasferire accuratamente l'ARNA eluiti ad una nuova piastra PCR (PCR o tubi).
22. (Passo opzionale) Controllare la concentrazione di RNA e la quantità di colorante nei campioni misurando 1.5μl su uno spettrofotometro NanoDrop utilizzando il modulo Microarray.
23. Immediatamente ibridare l'ARNA etichetta su una piattaforma microarray di vostra scelta, o, in alternativa, è possibile memorizzare l'ARNA etichettati a -80 ° C fino a quando si è pronti per l'ibridazione.

Tabella 1 ARNA Mix Binding

Reagente	Importo per 1 reazione
Perline RNA Binding *	10μl
Bead Resuspension * Soluzione	4μl
100% isopropanolo **	6μl
ARNA Concentrato Binding Buffer	50μl

* Mescolare le perline RNA legame con latallone soluzione risospensione prima
** Aggiungere l'isopropanolo e mescolare bene prima di aggiungere il legame tampone concentrato ARNA.

Discussione

Passaggi critici

Quando si esegue l'accoppiamento allilico aminoacidi, è fondamentale per risospendere il colorante in DMSO poco (meno di 1 ora) prima dell'accoppiamento e garantire l'acqua non entra nella tintura / DMSO mix, come si reagisce con il gruppo attivo sul colorante. Non asciugare eccessivamente l'RNA (può essere asciugati fino a 1-2uL piuttosto che completamente asciutto), e risospendere bene nel buffer di accoppiamento. Durante la reazione di accoppiamento, tener...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack	Reagent	GE Healthcare	RPN5661	Contains both Cy3 and Cy5 dyes
NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer	Other	NanoDrop	ND-1000	Or equivalent spectrophotometer