Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 3

Zusammenfassung

Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression. Teil 3 beschreibt den Prozess der Fluoreszenzmarkierung der amplifizierten RNA aus beiden Gastgeber und virale Proben durch Amino Allyl-Kupplung von Farbstoffen.

Zusammenfassung

Die Familie

Protokoll

Teil 1: aRNA Etikettierung: Aminosäuren Allyl-Kupplung der Farbstoffe

1. Add 1 g der Proben in 1,5 ml aRNA Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Vacuum trocknen die Proben auf geringe oder gar keine Hitze, bis sie vollständig trocken sind. Cap jedes Rohr, sobald es trocken ist - nicht übertrocknen!
3. Add 9μl Kupplungspuffer zu und die Dynabeads der aRNA durch vorsichtiges Vortexen für 1 Minute. Kurz zentrifugieren, um die Probe in den Boden des Röhrchens zu sammeln, und dann lassen Sie die Probe auf Eis zu sitzen.
4. Add 22μl hochwertige DMSO in jedes Röhrchen von Cy3 oder Cy5-Farbstoff. Ein Rohr von Farbstoff ist genug für 2 Proben. Der Cy3-Farbstoff wird zur Kennzeichnung Ihrer Referenzproben und die Cy5 Farbstoff zur Kennzeichnung Ihrer Proben.
5. Vortex die Farbstoffe zu durchmischen. Halten Sie die Farbstoffe in der Dunkelheit bis zur Verwendung. Bereiten Sie nicht Farbstoff früher als 1 Stunde vor dem Gebrauch. Achten Sie darauf, kein Wasser in den Farbstoff / DMSO-Mix zu jedem Zeitpunkt.
6. Fügen Sie 11μl der vorbereiteten DMSO / Cy Farbstoff zu jeder Probe. Gut mischen durch Vortexen sanft.
7. Inkubieren für 30-45 Minuten bei Raumtemperatur. Decken Sie die Proben mit Alufolie oder halten sie in einer Schublade, um Lichteinwirkung zu minimieren.
8. Nach der Inkubationszeit, fügen 4.5μl hydroxlyamine zu jeder Probe, um die Reaktion zu stillen. Gut mischen durch Vortexen sanft.
9. Inkubieren für weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur. Decken Sie die Proben mit Alufolie oder halten sie in einer Schublade, um Lichteinwirkung zu minimieren.

Teil 2: Labeled aRNA clean-up

1. Vortex die RNA-Bindung Perlen kurz, um eine gleichmäßige Mischung vor Gebrauch zu erhalten.
2. Bereiten Sie die aRNA Binding Mix bei Raumtemperatur. (Tabelle 1)
3. Gut mischen durch Vortexen.
4. Aliquot die aRNA Elutionspuffer in ein 1,5 ml Röhrchen und inkubieren bei 50-60 ° C für mindestens 10 Minuten.
5. Fügen Sie 70μl der aRNA verbindliche Mix zu jeder Probe und mischen Sie gut durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal.
6. Übertragen Sie die Proben aus der PCR-Platte, eine 96-Well-Rundboden-Platte.
7. Add 50 ul 100% Isopropanol zu jeder Probe und mischen Sie gut durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal.
8. Schütteln Sie die Platte auf einem Schüttler für mindestens 2 Minuten gründlich mischen der Proben.
9. Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. Lassen Sie die Platte auf dem Stand, bis die Mischung wird transparent und die Bindung Perlen haben pelletiert.
10. Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen. Der Überstand sollte entweder ein helles rosa oder hellblau an dieser Stelle aufgrund der Personengesellschaft Farbstoffmoleküle werden.
11. Die Platte aus dem magnetischen stehen.
12. Add 100 &mgr; aRNA Waschlösung in jede Kavität der Platte für 1 Minute auf dem Schüttler bei mäßiger Geschwindigkeit. Perlen können nicht vollständig in diesem Schritt zu zerstreuen.
13. Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen.
14. Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen.
15. Die Platte aus dem magnetischen stehen.
16. Wiederholen Sie die Wäsche ein ^2. Mal mit 100 &mgr; aRNA Waschlösung.
17. Nach dem ^2. waschen, trocknen die Kügelchen durch Schütteln der Platte für 1 Minute auf dem Schüttler bei maximaler Geschwindigkeit. Nicht übertrocknen Proben!
18. Eluieren aRNA von den Perlen, indem 20 &mgr; l vorgewärmten aRNA Elutionspuffer zu jeder Probe.
19. Kräftig schütteln, die Platte auf dem Schüttler für 3 Minuten, dann überprüfen Sie, ob die magnetischen Beads vollständig verteilt sind. Wenn nicht, weiter zittern.
20. Nachdem die magnetischen Beads vollständig zerstreut haben, bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. Der Überstand enthält die aufgeräumt, etikettiert aRNA Proben, und sollte entweder ein hellrosa oder hellblaue werden.
21. Sorgfältig Übertragung der eluierten aRNA einen neuen PCR-Platte (oder PCR-Röhrchen).
22. (Optionaler Schritt) Überprüfen Sie die RNA-Konzentration und der Menge an Farbstoff in den Proben durch die Messung 1.5μl auf einem NanoDrop Spektralphotometer mit der Microarray-Modul.
23. Unmittelbar hybridisieren die markierten aRNA auf einem Mikroarray-Plattform Ihrer Wahl, oder alternativ können Sie die markierten aRNA bei -80 ° C lagern, bis Sie bereit für die Hybridisierung sind.

Tabelle 1 aRNA Binding Mix

Reagens	Betrag für 1-Reaktion
RNA Binding Perlen *	10 &mgr; l
Bead Resuspension Solution *	4μl
100% Isopropanol **	6μl
aRNA Binding Buffer Concentrate	50 ul

* Mix der RNA-Bindung Perlen mit dembead Resuspension Lösung zunächst
** Fügen Sie das Isopropanol und gut mischen, bevor Sie die aRNA Bindungspuffer konzentrieren.

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Diskussion

Kritische Schritte

Bei der Durchführung der Amino-Allyl-Kupplung, ist es entscheidend, um den Farbstoff in DMSO kurz (weniger als 1 Stunde) vor der Kupplung resuspendieren und sicher kein Wasser in den Farbstoff / DMSO-Mix, wie es mit der aktiven Gruppe auf den Farbstoff reagieren wird. Nicht übertrocknen RNA (kann bis auf 1-2UL anstatt völlig trocken getrocknet werden), und resuspendieren und in dem Bindungspuffer. Während der Kupplungsreaktion, halten Sie die Reaktion in der Dunkelheit, ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack	Reagent	GE Healthcare	RPN5661	Contains both Cy3 and Cy5 dyes
NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer	Other	NanoDrop	ND-1000	Or equivalent spectrophotometer