Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 3

Summary

פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 3 מתאר את תהליך fluorescently תיוג RNA מוגבר מן המארח והן דגימות ויראלי באמצעות צימוד allyl אמינו של צבעים. חלק 3 מתוך 3.

Abstract

המשפחה

Protocol

חלק 1: ארנה תיוג: צימוד allyl אמינו של צבעים

1. הוסף 1μg של דגימות ארנה לתוך צינורות microcentrifuge 1.5mL.
2. אבק יבש דגימות על אש נמוכה או לא עד שהם יבשים לחלוטין. שווי כל צינור ברגע שהוא יבש - לא overdry!
3. הוסף חוצץ צימוד 9μl אל צינור כל resuspend ארנה ידי בעדינות vortexing דקה 1. צנטריפוגה בקצרה לאסוף את דגימת בתחתית של התחתית, ואחר כך לתת המדגם לשבת על הקרח.
4. הוסף 22μl DMSO איכות גבוהה של כל שפופרת צבע Cy3 או Cy5. שפופרת אחת של צבע מספיק 2 דגימות. לצבוע Cy3 היא תיוג דגימות לעיונך, ואת צבע Cy5 היא תיוג דגימות הבדיקה.
5. מערבולת צבעים לערבב היטב. שמור את צבעי בחושך עד מוכן לשימוש. אין להכין צבע מוקדם יותר מאשר 1 שעה לפני השימוש. ודא מים לא נכנס לערבב צבע / DMSO בכל נקודה.
6. הוסף 11μl של צבע DMSO / סיי מוכן מדגם זה. מערבבים היטב על ידי vortexing בעדינות.
7. דגירה של 30-45 דקות בטמפרטורת החדר. מכסים את דגימות עם נייר כסף או לשמור אותם במגירה כדי למזער את החשיפה לאור.
8. לאחר דגירה, מוסיפים 4.5μl hydroxlyamine לטעום כל להרוות את התגובה. מערבבים היטב על ידי vortexing בעדינות.
9. דגירה לעוד 15 דקות בטמפרטורת החדר. מכסים את דגימות עם נייר כסף או לשמור אותם במגירה כדי למזער את החשיפה לאור.

חלק 2: תווית ארנה לנקות

1. וורטקס החרוזים RNA מחייב בקצרה להשיג תערובת אפילו לפני השימוש.
2. מכינים את תערובת ארנה איגוד בטמפרטורת החדר. (לוח 1)
3. מערבבים היטב על ידי vortexing.
4. Aliquote הצפת elution ארנה לתוך צינור דגירה 1.5mL ועל 50-60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות.
5. הוסף 70μl של תמהיל ארנה מחייב כל דגימה ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
6. העברת דגימות הצלחת PCR לצלחת מסביב לתחתית 96-היטב.
7. הוסף 50μl של 100% isopropanol לטעום כל ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
8. נער בעדינות את הצלחת על שייקר מסלולית לפחות 2 דקות לערבב ביסודיות את הדגימות.
9. הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. השאירו את הצלחת על דוכן העדים עד שהתערובת הופכת שקופה חרוזי מחייב יש pelleted.
10. בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant. Supernatant צריך להיות או ורוד בהיר או כחול בהיר, בשלב זה, בשל מולקולות צבען מאוגדים.
11. הסר את צלחת מדוכן מגנטי.
12. הוסף 100μl פתרון ארנה שטפי זה טוב לטלטל את הצלחת דקה 1 על שייקר מסלולית במהירות בינונית. חרוזים לא יכול לפזר באופן מלא בשלב זה.
13. הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים.
14. בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant.
15. הסר את צלחת מדוכן מגנטי.
16. חזור על לשטוף זמן 2 ^nd עם פתרון לשטוף ארנה 100μl.
17. לאחר לשטוף 2 ^nd, לייבש את החרוזים על ידי רועדת את הצלחת דקה 1 על שייקר מסלולית במהירות המקסימלית. אל overdry דגימות!
18. Elute ארנה מן החרוזים ידי הוספת מאגר 20μl שחומם מראש ארנה elution לטעום כל אחד.
19. בתוקף ללחוץ את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 3 דקות, ואז לבדוק כדי לוודא חרוזים מגנטיים מפוזרים באופן מלא. אם לא, ממשיכים לרעוד.
20. לאחר חרוזים מגנטיים התפזרו לגמרי, להעביר את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. Supernatant מכיל את ניקה, דגימות ארנה שכותרתו, וצריך להיות או ורוד חיוור או כחול חיוור.
21. בזהירות העברת ארנה eluted לצלחת PCR חדש (או צינורות PCR).
22. (שלב אופציונאלי) בדוק את ריכוז RNA ואת כמות הצבע בדגימות ידי מדידת 1.5μl על ספקטרופוטומטר NanoDrop באמצעות מודול microarray.
23. מיד להכליא ארנה שכותרתו על גבי פלטפורמת microarray של הבחירה שלך, או לחילופין, ניתן לאחסן את ארנה שכותרתו ב -80 ° C עד שאתה מוכן הכלאה.

טבלה 1 ארנה איגוד Mix

מגיב	סכום עבור תגובה 1
RNA חרוזים עקידת *	10μl
הפתרון ביד Resuspension *	4μl
100% isopropanol **	6μl
ארנה תתרכז הצפת הכבילה	50μl

* מערבבים את החרוזים RNA מחייב עםחרוז פתרון resuspension first
** מוסיפים את isopropanol ומערבבים היטב לפני הוספת להתרכז חיץ מחייב ארנה.

Discussion

קריטי שלבים

בעת ביצוע צימוד allyl אמינו, זה הוא קריטי resuspend לצבוע ב DMSO זמן קצר (פחות מ 1 שעה) לפני צימוד ולהבטיח מים לא נכנס לערבב צבע / DMSO, כפי שהוא יגיב עם קבוצת פעילים על הצבע. אל overdry רנ"א (יכול להיות מיובש עד 1-2uL ולא יבש לגמרי), ואת resusp...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack	Reagent	GE Healthcare	RPN5661	Contains both Cy3 and Cy5 dyes
NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer	Other	NanoDrop	ND-1000	Or equivalent spectrophotometer