JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 3 описывает процесс флуоресцентно маркировки усиливается РНК из хозяина и вирусных образцов аминокислот аллилового связи красителей. Часть 3 из 3.

Аннотация

Семья

протокол

Часть 1: Арна маркировки: аминокислоты связи аллил из красителей

  1. Добавить 1 мкг образцов Арна в 1,5 мл труб микроцентрифужных.
  2. Вакуумные сухие образцы на низкой или нулевой температуре, пока они полностью не высохнут. Cap каждой трубки, как только она сухая - не пересушить!
  3. Добавить 9μl связи буфера в каждую пробирку и ресуспендируйте Арна, осторожно вортексе в течение 1 минуты. Центрифуга кратко собрать образец в нижней части трубки, а затем дать образец сидеть на льду.
  4. Добавить 22μl высокой ДМСО качества для каждой трубки Cy3 или Cy5 красителя. Один трубку краситель достаточно для 2 образцов. Красителя Cy3 для маркировки вашего эталонных образцов, и краситель Cy5 для маркировки ваши образцы тестов.
  5. Vortex красителей тщательно перемешать. Держите красителей в темноте, пока готов к использованию. Не готовьте красителя ранее чем за 1 час перед использованием. Убедитесь, что вода не попадает в красителях / ДМСО смесь в любой момент.
  6. Добавить 11μl подготовленных ДМСО / Су краситель для каждого образца. Хорошо перемешайте на вортексе мягко.
  7. Инкубируйте в течение 30-45 минут при комнатной температуре. Обложка образцы с фольги или держать их в ящик, чтобы минимизировать воздействие света.
  8. После инкубации, добавьте 4.5μl hydroxlyamine для каждого образца, чтобы утолить реакции. Хорошо перемешайте на вортексе мягко.
  9. Инкубируйте в течение еще 15 минут при комнатной температуре. Обложка образцы с фольги или держать их в ящик, чтобы минимизировать воздействие света.

Часть 2: Маркированный Арна очистке

  1. Vortex связывание РНК бисером кратко получить даже смесь перед использованием.
  2. Подготовка Арна Связывание Смешать при комнатной температуре. (Табл. 1)
  3. Хорошо перемешайте на вортексе.
  4. Aliquote буфера Арна Элюирование в 1,5 мл трубки и инкубировать при 50-60 ° С в течение не менее 10 минут.
  5. Добавить 70μl из Арна обязательным смеси для каждого образца и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза.
  6. Передача образца от пластины ПЦР для 96-луночного круглым дном тарелку.
  7. Добавить 50 мкл 100% изопропанола к каждому образцу и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза.
  8. Осторожно встряхните пластину на орбитальный шейкер, по крайней мере 2 минуты для тщательного перемешивания образцов.
  9. Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус. Оставьте пластину на стенде, пока смесь не станет прозрачной и обязательным бисера гранулированный.
  10. Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант. Супернатант должен быть либо ярко-розовый или ярко-голубые на данный момент из-за неинкорпорированных молекул красителя.
  11. Удалите пластину из магнитного стенда.
  12. Добавить 100 мкл Арна промывочного раствора в каждую лунку и встряхните пластине в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при умеренной скорости. Бусины могут не расходиться на этот шаг.
  13. Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус.
  14. Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант.
  15. Удалите пластину из магнитного стенда.
  16. Повторите мыть 2-й раз с 100 мкл промывочного раствора Арна.
  17. После 2-й вымыть, обсушить бисером встряхиванием пластины в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при максимальной скорости. Не пересушить образцы!
  18. Элюировать Арна из бисера, добавляя 20 мкл предварительно нагретую Элюирование Арна буфера для каждого образца.
  19. Энергично встряхните пластину на орбитальном шейкере в течение 3 минут, а затем проверить, чтобы убедиться, магнитных шариков полностью рассеялись. Если нет, то продолжать дрожать.
  20. После магнитных шариков полностью рассеяны, перемещать пластину магнитного стоять, чтобы захватить магнитных шариков. Супернатант содержит в порядок, помечены образцы Арна, и должно быть или бледно-розового или бледно-голубым.
  21. Тщательно передачи элюировали Арна к новой пластинкой ПЦР (или ПЦР).
  22. (Необязательный шаг) Проверьте концентрацию РНК и количество красителя в образцах путем измерения 1.5μl на NanoDrop спектрофотометр использования Microarray модуля.
  23. Сразу гибридизации меченых Арна на микрочипов платформы на ваш выбор, или в качестве альтернативы, вы можете хранить помечены Арна при -80 ° С, пока вы не готовы к гибридизации.

Таблица 1 Арна Связывание Mix

Реагент Сумма за 1 реакция
Связывание РНК бисер * 10 мкл
Бусы ресуспендирования Решение * 4μl
100% изопропанола ** 6μl
Арна Связывание Концентрат буфера 50 мкл

* Смешать связывание РНК бисер сбусинка ресуспендирования решение первой
** Добавьте изопропанола и хорошо перемешать перед добавлением Арна обязательным концентрат буфера.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Критические Шаги

При выполнении аминокислоты аллилового связи, очень важно для ресуспендирования красителя в ДМСО незадолго (менее 1 часа), прежде чем связь и убедиться в отсутствии воды попадает в красителях / ДМСО смеси, как он будет реагировать с активными группы по кр?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

Уайтхед Институт стипендиаты фондов

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
CyDye Post-Labeling Reactive Dye PackReagentGE HealthcareRPN5661Contains both Cy3 and Cy5 dyes
NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometerOtherNanoDropND-1000Or equivalent spectrophotometer

Ссылки

  1. Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
  2. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
  3. Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
  4. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
  5. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
  6. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
  7. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
  8. Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

26VacciniaHeLaMicroarrayAmino MessageAmpII

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены