工程细胞透水蛋白

摘要

蛋白转导使进入细胞的生物活性蛋白的直接传递。相反，如DNA转染或病毒转导的传统方法，这种非侵入性的范式允许在滴定的细胞毒性和永久性的基因改造的致癌转化的风险规避方式高效蜂窝操作。

摘要

蛋白转导技术，使哺乳动物细胞的生物活性物质的直接交付[ ^复查见 1,2 ]。对于这种人可以使用所谓的细胞穿透肽（CPPS）的转位能力，也被指定为蛋白转导域（PTD的）。 TAT - CPP的由人类免疫缺陷病毒1型（HIV - 1）达（反转录激活）蛋白已被广泛应用于派生。带正电的达促进细胞的通透性，从 ​​而克服障碍的细胞膜内吞作用和/或直接^膜渗透2。结合核定位信号（NLS）的融合蛋白能够进入细胞核展示功能。我们的视频演示表明，作为细胞渗透蛋白质工程，施工，生产和应用一个细胞的DNA修饰酶Cre重组透水版本的例证。

CRE是一个特定地点的重组，能够识别和重组在哺乳动物细胞在体外和体内的34个碱基对loxP位网站。因此的Cre / loxP系统被广泛用于有条件地诱导在活细胞^3,4的基因组的突变。然而，传递到细胞积极Cre重组的限制。

我们描述的pSESAME载体系统，它允许一个直接插入的基因利益，并提供了一​​个平台，可迅速克隆不同的域和向量的内标签在一个方便的和标准化的方式使用。重新安排不同的标记已被证明修改的融合提供了可能性，以达到更高的的产量和更好的溶解度蛋白的生化特性。我们演示了如何表达和纯化在大肠杆菌和重组细胞的permeant蛋白。在细胞培养的Cre重组蛋白的功能最终验证评估其细胞内的重组活动。

研究方案

构建的表达载体，并表达：

pSESAME - Cre重组表达载体，通过插入到pSESAME创建编码通过使用标准的克隆方法网站AvrII和NheI限制片段。 pSESAME编码一个融合蛋白组氨酸标签，达域，免入息审查贷款计划的序列和CRE，略HTNCre组成。 pSESAME - CRE表达的HTNCre转化TUNER（DE3）pLacI和用于制备甘油股票。

1. 使用吸管尖端涂有甘油转化菌接种过晚的文化。通宵文化，辅以0.5％葡萄糖的LB培养基[V / V]和羧在终浓度为50微克/毫升和增长在37 ° C时16个小时。
2. 第二天，密集种植晚文化是用于接种的比例为1至40的表达文化和孵化器在37 ° C包括在终浓度为100微克/毫升与0.5％葡萄糖[V / V]和氨苄青霉素补充的结核病媒体表达文化。
3. 在外径₅₉₅ ​​1.5用0.5毫米1小时IPTG诱导表达文化
4. 随后离心收集细菌在5000 SLA3000转子在一个10分钟的转速。
5. 细菌的颗粒被储存在零下20 ° C直到净化。

细胞渗透蛋白的纯化：

1. 冷冻细菌悬浮颗粒在10毫升每公升瓶培养裂解缓冲在室温下15分钟。
2. 悬液，孵育1 mg / mL的额外15分钟的溶菌酶，而在室温下搅拌。
3. 25 U / mL的benzonase是事后补充和培养，同时为在室温下15分钟搅拌。
4. 冰sonification 45％的功率为1.5分0.5秒脉冲后，1毫升冷酒石酸盐缓冲液（TSB），每毫升悬浮液进行了仔细的添加而混合和孵育5分钟就冰。 SDS - PAGE分析裂解分数（L）的样品被送到。
5. 清除裂解，得到了离心30,000 g.℃30分钟的4可溶性（S）和不溶性组分（一）的SDS - PAGE样品。
6. 上清液转移食入50毫升猎鹰管，然后轻轻地在4 h 1℃，2毫升50％的镍NTA每升初步表达文化的泥浆混合。
7. 暂停被包装成一个重力流EconoPac列（SDS - PAGE电泳流通过分数（FT）的样本）和洗涤液与5床卷洗2次。都洗分数（W1和W2的）的SDS - PAGE样品采集。
8. HTNCre含分数分别为3床体积分数（五）洗脱液洗脱缓冲液和样品进行SDS - PAGE分析洗脱。
9. 咪唑被删除两次透析对高盐缓冲液洗脱分数。
10. 进一步浓缩蛋白质溶液对甘油缓冲液透析两次。所有透析步骤中的缓冲区，以样本的比例至少为50。此过程中甘油股票HTNCre解决方案通常浓度在200和450微米之间，即1公升表达文化的结果〜12毫克的蛋白质。甘油（GS）的样品用于SDS - PAGE分析收集。 HTNCre原液可以被储存在零下20 ° C。

图1：Cre重组酶的纯化过程中收集的样本的SDS - PAGE分析。诱导的Cre表达的是主导乐队，在裂解馏分表示。虽然是不溶性的蛋白质的一部分的Cre蛋白可以进一步丰富洗脱液和甘油分数。 L：裂解液，我：不溶于水，S：取上清液，FT：流通型，W：洗涤，电子邮件：洗脱液，GS：Gylcerol股票。请点击这里看到图1的放大版本。

蛋白转导到小鼠胚胎干细胞（ES）：

1. 使用贴壁细胞解离TrypLE™Express的单细胞胚胎干细胞携带一个有条件的β-半乳糖苷酶^记者 5构造接种。 4至6小时后，细胞重新连接和中期被拆除。
2. 随后，胚胎干细胞培养与HTNCre含16个小时的中等。
   • HTNCre蛋白质的适量（相当于10微米）的甘油稀释成ES中期和随后无菌过滤（0.22微米）。
3. 蛋白转导介质后改回正常生长介质。
4. 经过两天的细胞用PBS洗涤，用10分钟的4％多聚甲醛（PFA）固定。
5. 两个额外X - gal染色前用PBS tional洗涤步骤执行。
6. 固定细胞，X - gal染色溶液⁶层覆盖，并在37 ° C孵育过夜

代表性的成果：

第二天，X - gal染色的解决办法是渴望和细胞覆盖层的PBS显微镜分析。可观察到80至100％的重组细胞在小鼠ES细胞β-半乳糖苷酶的活性来判断。

讨论

在Cre重组融合蛋白的纯化过程，重要的是不要忽略除了冰冷的TBS缓冲液离心前。否则Cre重组甘油缓冲区内趋于沉淀。

如果洗脱液分数似乎变得混浊由于融合蛋白额外的洗脱缓冲液的高浓度应增加，直到解决方案已被清除再次。

Cre重组融合蛋白的10微米的应用通常会导致重组效率在80％至100％。小牛血清（FCS）的ES细胞的培养基中的重要组成部分，强烈地抑制蛋白转导。因此Cre重组酶的高浓度，必须使用。在无血清的条件下工作时，可以使用较少的蛋白质（0.5 - 2微米）来实现类似的重组效率。

与手头pSESAME载体系统，可以适用于其他蛋白质，包括转录因子，如Oct4 ^和 Sox2基因^第 7和Scl/Tal1 8的蛋白转导技术。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
TUNER (DE3) pLacI	Novagen, EMD Millipore	70625
Glycerol	Carl Roth GmbH	3783.2
Na2HPO4	Carl Roth Gmbh	T876.1
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
HCl	Carl Roth Gmbh	4625.1
Imidazol	Carl Roth Gmbh	X998.4
NaCl	Carl Roth Gmbh	9265.2
Yeast Extract	Carl Roth Gmbh	2363.4
Trypton/Pepton	Carl Roth Gmbh	8952.4
K2HPO4	Carl Roth Gmbh	P749.2
KH2PO4	Carl Roth Gmbh	3904.1
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Carbenicillin	Sigma-Aldrich	6344.2
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Lysozyme	Sigma-Aldrich	62971
Benzonase	Novagen, EMD Millipore
L-Tartaric acid, disodium salt	Sigma-Aldrich
50% Ni-NTA slurry	Invitrogen	R901-15
EconoPac columns	Bio-Rad	732-1010
Sterile filter 0,22μm	Whatman, GE Healthcare
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich
LB medium			Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl
TB medium			Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4
Lysis Buffer			50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8
Tartaric Salt Buffer (TSB)			PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol
Washing Buffer			PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol
Elution Buffer			PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol
High Salt Buffer			600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
Gylcerol Buffer			50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
TrypLE™ Express	Invitrogen
ESGRO (LIF)	EMD Millipore
NEAA	GIBCO, by Life Technologies	11140035
L-Glutamin	GIBCO, by Life Technologies	25030024
β-Mercapt–thanol	GIBCO, by Life Technologies	31350010
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	11960044
PBS	GIBCO, by Life Technologies
Fetal Calf Serum (FCS)	PAA Laboratories
X-Gal staining solution:			4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS
K3(FeIII(CN)6)	Sigma-Aldrich	P-3367
K4 (FeII(CN)6)	Sigma-Aldrich	P-9387
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
X-Gal	Sigma-Aldrich	B4252