Ingénierie cellulaire perméable protéines

Résumé

Transduction des protéines permet la livraison directe de protéines biologiquement actives dans les cellules. Contrairement aux méthodes conventionnelles telles que la transfection d'ADN ou de transduction virale ce paradigme non invasive permet une manipulation très efficace cellulaires de façon titrable contourner la toxicité cellulaire et le risque de transformation oncogénique par modification génétique permanente.

Résumé

La technique de transduction de protéines permet la livraison directe du matériel biologiquement active dans les cellules de mammifères [pour revue, voir ^1,2]. Pour cela, on peut faire usage de la capacité translocation des peptides cellule dite pénétrante (CPP), également désigné comme domaines de transduction protéique (DAP). Le TAT-RPC dérivés du type de virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) Tat (trans-activateur de la transcription) des protéines a été largement utilisé. Les chargés positivement TAT favorise la perméabilité des cellules permettant ainsi de surmonter les barrières de la membrane cellulaire par endocytose et / ou la pénétration de membrane directe ^2. En combinaison avec un signal de localisation nucléaire (NLS) des protéines de fusion sont capables d'entrer dans le noyau de fonctionnalité exposantes. Notre vidéo de présentation démontre, comme une ampliation de l'ingénierie des protéines cellulaires perméables, la construction, la production et l'application d'une version de cellules-perméable de la CRE ADN modification enzymatique.

Cre est une recombinase site-spécifique qui est capable de reconnaître et de se recombiner 34 sites loxP dans paires de base des cellules de mammifères in vitro et in vivo. Par conséquent, le système Cre / loxP est largement utilisé pour induire des mutations conditionnellement dans le génome de ^3,4 cellules vivantes. La livraison des actifs de la recombinase Cre dans les cellules, cependant, représente une limitation.

Nous décrivons le système vectoriel pSESAME, ce qui permet une insertion directe du gène d'intérêt et fournit une plateforme pour cloner rapidement les différents domaines et les tags utilisés dans le vecteur d'une manière commode et standardisés. Réorganisation des balises différentes a été montré pour modifier les propriétés biochimiques des protéines de fusion offrant une possibilité d'atteindre un rendement supérieur et une meilleure solubilité. Nous démontrons comment exprimer et de purifier les cellules recombinantes perméants protéines à l'intérieur et de E. coli. La fonctionnalité de la protéine recombinante Cre est finalement validé en culture cellulaire en évaluant son activité recombinase intracellulaire.

Protocole

Construction du vecteur d'expression et d'expression:

Le vecteur d'expression pSESAME-Cre a été construit en insérant un fragment de Cre-encodage dans pSESAME via des sites de restriction Avril et Nhel utilisant des méthodes de clonage standard. pSESAME code pour une protéine de fusion constituée d'une histidine-tag, TAT-domaine, séquence NLS et la CRE, en abrégé HTNCre. Pour l'expression de HTNCre pSESAME-Cre a été transformé en TUNER (DE3) Placi et utilisés pour préparer un stock de glycérol.

1. Une culture durant la nuit a été inoculé avec une pointe de pipette enduits de bactéries transformées par le stock de glycérol. La culture du jour au lendemain se composait de milieu LB supplémenté en glucose 0,5% [v / v] et carbénicilline à une concentration finale de 50 pg / ml et a été autorisé à croître à 37 ° C pendant 16 heures.
2. Le lendemain, le plus densément cultivée nuit de la culture a été utilisée pour inoculer la culture d'expression à un ratio de 1 à 40 et a été mis dans un incubateur à 37 ° C. Expression de la culture se composait des médias tuberculose complété par du glucose à 0,5% [v / v] et l'ampicilline à une concentration finale de 100 pg / mL.
3. A une DO ₅₉₅ de 1,5 à la culture d'expression a été induite avec 0,5 mM d'IPTG pendant 1 h.
4. Par la suite les bactéries ont été recueillies par centrifugation à 5000 rpm pendant 10 minutes dans un rotor SLA3000.
5. Les bactéries ont été granulés stockés à -20 ° C jusqu'à la purification.

Purification des cellules perméables protéines:

1. Frozen granulés bactéries ont été remises en suspension dans 10 ml de tampon de lyse par culture flacon litre pendant 15 minutes à température ambiante.
2. La suspension a été ensuite incubés avec 1 mg / ml de lysozyme pour d'autres 15 minutes tout en mélangeant à température ambiante.
3. 25 U / mL a été ajouté par la suite benzonase et incubé tout en mélangeant pendant 15 minutes à température ambiante.
4. Après sonication sur glace pendant 1,5 minutes avec des impulsions s 0,5 à 45% de la puissance, 1 ml de tampon froid sel tartrique (BST) par ml de suspension a été soigneusement ajouté tout en mélangeant et incubé pendant 5 min sur la glace. SDS-PAGE de la fraction de l'échantillon lysat (L) a été prise.
5. Lysat clarifié a été obtenu par centrifugation à 4 ° C pendant 30 min à 30000 g. SDS-PAGE des échantillons de fractions solubles (S) et insoluble (I) ont été prises.
6. Le surnageant a été transféré dans de nouveaux tubes de 50 ml Falcon et a ensuite été délicatement mélangés pendant 1 h à 4 ° C avec 2 ml de 50% de Ni-NTA boue par litre de culture d'expression initiale.
7. La suspension a été emballé dans une colonne à écoulement par gravité EconoPac (SDS-PAGE de l'échantillon de l'écoulement à travers la fraction (FT) a été prise) et lavé deux fois avec 5 volumes de lit de tampon de lavage. SDS-PAGE des échantillons des deux fractions de lavage (W1 et W2) ont été collectés.
8. HTNCre fractions contenant ont été élues avec 3 lits volumes de tampon d'élution et l'échantillon de la fraction d'éluat (E) pour analyse SDS-PAGE a été prise.
9. Imidazole a été éliminée par dialyse contre le tampon d'élution fraction élevée de sel à deux reprises.
10. La solution de protéine a été encore concentré par dialyse contre du tampon glycérol deux fois. Dans toutes les étapes de dialyse le ratio de tampon d'échantillon a été d'au moins 50. Cette procédure a abouti à une solution stock de glycérol contenant HTNCre à une concentration d'habitude entre 200 et 450 uM, soit 1 litre de culture d'expression se traduira par environ 12 mg de protéine. Exemple de stock glycérol (GS) pour analyse SDS-PAGE ont été recueillis. Solution stock HTNCre peuvent être stockés à moins 20 ° C.

Figure 1: analyse SDS-PAGE des échantillons prélevés pendant le processus de purification de recombinase Cre. L'induction de l'expression de Cre est indiquée par la bande dominante de la fraction lysat. Bien qu'une partie de la protéine est insoluble la protéine Cre peut encore être enrichi comme on le voit dans l'éluat et les fractions d'actions de glycérol. L: lysat, I: Insoluble, S: surnageant, FT: Flow-through, W: linge, E: éluat, GS: Stock Gylcerol. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 1.

Transduction des protéines dans murin souches embryonnaires (ES) cellules:

1. Les cellules ES portant une conditionnelle β-galactosidase journaliste de ⁵ construire ont été ensemencées en utilisant des cellules individuelles TrypLE ™ Express pour la dissociation des cellules adhérentes. Après 4 à 6 heures, les cellules ont re-joint et le milieu a été enlevé.
2. Par la suite les cellules ES ont été incubées avec un milieu contenant du HTNCre pendant 16 heures.
   • Une quantité appropriée de protéines HTNCre (correspondant à 10 pM) sur le stock de glycérol a été dilué dans le milieu de ES et filtré par la suite stériles (0,22 m).
3. Après moyennes de transduction de protéines a été modifié pour revenir à un milieu de croissance normal.
4. Après deux jours cellules ont été lavées avec du PBS et fixées avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) pendant 10 minutes.
5. Deux suppléinternationale étapes de lavage avec du PBS ont été exécutés avant X-Gal coloration a été réalisée.
6. Les cellules fixées ont été couverts d'une couche de solution de coloration X-Gal ⁶ et incubée pendant la nuit à 37 ° C.

Les résultats représentatifs:

Suivant une solution de coloration X-Gal jour a été aspiré et les cellules ont été recouvertes d'une couche de PBS pour l'analyse microscopique. 80 à 100% de cellules recombinées pu être observé dans les cellules ES murines jugés par β-galactosidase.

Discussion

Pendant le processus de purification de la protéine fusion Cre il est important de ne pas omettre l'ajout de la glace froide tampon TBS avant la centrifugation. Sinon recombinase Cre tend à précipiter dans la mémoire tampon glycérol.

Si la fraction de l'éluat semble devenir trouble dû à la forte concentration de protéine de fusion élution tampon supplémentaire doit être ajouté jusqu'à ce que la solution a autorisé à nouveau.

L'application de 10 uM de la protéine fusion Cre entraîne habituellement une efficacité de recombinaison de 80 à 100%. Sérum de veau foetal (FCS) étant une composante importante du milieu de cellules ES inhibe fortement la transduction des protéines. Par conséquent une forte concentration de la recombinase Cre a dû être utilisé. Lorsque vous travaillez dans un milieu sans sérum moins de protéines (0,5 - 2 M) peut être utilisé pour réaliser des économies recombinaison similaires.

Avec le système vectoriel pSESAME à portée de main, on peut appliquer la technique de transduction protéique à d'autres protéines, y compris les facteurs de transcription tels que Oct4 et Sox2 ⁷ et ⁸ Scl/Tal1.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
TUNER (DE3) pLacI	Novagen, EMD Millipore	70625
Glycerol	Carl Roth GmbH	3783.2
Na2HPO4	Carl Roth Gmbh	T876.1
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
HCl	Carl Roth Gmbh	4625.1
Imidazol	Carl Roth Gmbh	X998.4
NaCl	Carl Roth Gmbh	9265.2
Yeast Extract	Carl Roth Gmbh	2363.4
Trypton/Pepton	Carl Roth Gmbh	8952.4
K2HPO4	Carl Roth Gmbh	P749.2
KH2PO4	Carl Roth Gmbh	3904.1
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Carbenicillin	Sigma-Aldrich	6344.2
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Lysozyme	Sigma-Aldrich	62971
Benzonase	Novagen, EMD Millipore
L-Tartaric acid, disodium salt	Sigma-Aldrich
50% Ni-NTA slurry	Invitrogen	R901-15
EconoPac columns	Bio-Rad	732-1010
Sterile filter 0,22μm	Whatman, GE Healthcare
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich
LB medium			Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl
TB medium			Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4
Lysis Buffer			50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8
Tartaric Salt Buffer (TSB)			PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol
Washing Buffer			PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol
Elution Buffer			PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol
High Salt Buffer			600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
Gylcerol Buffer			50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
TrypLE™ Express	Invitrogen
ESGRO (LIF)	EMD Millipore
NEAA	GIBCO, by Life Technologies	11140035
L-Glutamin	GIBCO, by Life Technologies	25030024
β-Mercapt–thanol	GIBCO, by Life Technologies	31350010
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	11960044
PBS	GIBCO, by Life Technologies
Fetal Calf Serum (FCS)	PAA Laboratories
X-Gal staining solution:			4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS
K3(FeIII(CN)6)	Sigma-Aldrich	P-3367
K4 (FeII(CN)6)	Sigma-Aldrich	P-9387
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
X-Gal	Sigma-Aldrich	B4252