斑马鱼化工屏幕自动成像和分析的发展。

摘要

我们报告的自动成像系统和分析在多孔板的转基因斑马鱼的胚胎的发展。这表明成纤维细胞生长因子记者的基因表达的能力来衡量的一个小分子，BCI，​​剂量依赖效应，并提供技术建立高通量的斑马鱼化工屏幕。

摘要

我们演示了基于图像的高内涵筛选（HCS）的方法来识别，可以调节斑马鱼的胚胎中的FGF / RAS / MAPK通路的小分子的应用程序。斑马鱼的胚胎是在体内高含量的化学屏幕的理想系统。 1日龄胚胎直径约1mm，可以很容易地排列到96孔板，为高通量筛选的标准格式。在发展的第一天，胚胎透明，大部分目前的主要器官，从而使组织形成的胚胎发育过程中的可视化。然而，斑马鱼化工屏幕的完整的自动化仍然是一个挑战，特别是在自动化图像采集和分析的发展。我们先前生成的转基因绿色荧光蛋白（GFP）的FGF活动的控制下，记者一行表示，并展示了在化学屏幕它们的效用

研究方案

1）设置斑马鱼交配和BCI治疗。

1. 前两天的治疗，查明纯合子男性^{TG（dusp6：d2eGFP）PT6}斑马鱼和地点单独进入交配坦克^1。添加分隔符和野生型AB *女鱼交配笼留下过夜。
2. 第二天早晨去掉分隔，并收集1小时后的胚胎。胚胎转移至100mm菜E3（5毫米氯化钠，0.17 mM的氯化钾，氯化钙，0.33毫米0.33 mM的硫酸镁），解决方案，并在6小时28 ° C孵育。去除死皮和未受精的胚胎，补充新鲜的E3解决方案，并孵育过夜。
3. 排序类似的阶段（24hpf）和统一的绿色荧光蛋白表达的转基因胚胎。阵列胚胎分别为每孔96孔板。
4. 除去多余E3的解决方案与微。添加到每口井的多通道移液器200μL的E3的解决方案。
5. 添加列出下列化合物：
   
   

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   一

   2μL 二甲基亚砜

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5）

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5）

   2μL 二甲基亚砜

   乙

   2μL 二甲基亚砜

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5）

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5）

   2μL 二甲基亚砜

   彗星

   2μL 二甲基亚砜

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5）

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5）

   2μL 二甲基亚砜

   ð

   2μL 二甲基亚砜

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

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   2μL BCL （0.1MM）

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   2μL BCL （1MM）

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   2μL BCL （2.5）

   2μL 二甲基亚砜

   Ë

   2μL 二甲基亚砜

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5）

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5）

   2μL 二甲基亚砜

   F

   2μL 二甲基亚砜

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5）

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5）

   2μL 二甲基亚砜

   摹

   2μL 二甲基亚砜

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5）

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5米M）

   2μL 二甲基亚砜

   H

   2μL 二甲基亚砜

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5）

   2μL BCL （0.1MM）

   2μL BCL （0.5MM）

   2μL BCL （1MM）

   2μL BCL （2MM）

   2μL BCL （2.5）

   2μL 二甲基亚砜

   终浓度1μM，5μM，10μM，20μM，25μm的景气指数在1％DMSO。覆盖铝箔板和孵育6小时，在28 ° C。

2）自动成像96孔板和分析。

1. 添加tricaine（0.61mM）加入10μl，每孔麻醉30hpf胚胎。
2. 装入Imagexpress超分子器件板块。
3. 打开Metaxpress软件。选择一个具有4倍的目标和最大的针孔直径的配置，配置激光自动对焦检测板的底部，并确定最佳的Z平面检测感兴趣区域。收购五百二十五分之四百八十八纳米（GFP）的激发/发射波长的图像。设置扫描面积为2000x2000像素（4 x 4毫米），没有分级的单一站点。配置的激光功率和增益等，阳性对照图像中最亮的地区不饱和。在一些正面和负面的控制井确认正确的图像采集。
4. 启动盘扫描。该仪器将自动获得所有的水井和归档他们在SQL Server数据库中的图像。
5. 上传到Definiens的开发，使用的Cellenger应用模块和进口过滤器，承认Imagexpress超分子器件平台产生的图像格式和文件结构的图像。
6. 定制设计的认知网络技术算法（也称为规则集）的过程映像。设计的算法，我们定制开发的基于最近公布的规则集^2，自动识别胚，蛋黄，和头部，并量化表达GFP的头结构的亮度和面积。在其中没有发现胚胎或头部不能被明确指定（例如，具有高毒性化合物或出重点图像）井是从分析中排除。配置的算法，使用一些负面控制图像（车辆处理）和阳性对照图像（BCI的治疗），正确地确定两个头和蛋黄等。 “头结构”平均蛋黄强度的倍数检测阈值设置，直到明亮的头部结构的检测与目视观察。定义参数的出口。在这个例子中，最翔实的参数是头以下称为“总头结构的亮度”（图1），GFP阳性区域内的总集成的亮度。
   
   
   图1
   图depicitng的BCI的剂量依赖效应，对绿色荧光蛋白在转基因胚胎的表达。
7. 运行在所有板块的图像，使用集成的作业调度算法。 Definiens的软件使用多个处理器的分布式计算（“引擎”），使多个图像的同时分析。该算法计算，这是处理后的图像的副本保存在数据库中的图像分析应用与分析，结果为基础的数值措施。

代表性的成果：

所有的图像进行分析后，数据可以被可视化内Cellenger或出口到第三方软件（EXCEL，GraphPad棱镜）作进一步的分析和图形表示。图2显示从处理过的车辆存档的扫描图像和一个BCI的无CNT的分析应用，良好的待遇。图1文件GFP报告基因的表达在TG（dusp6：d2EGFP）的BCI的剂量依赖效应^PT6胚胎。引出一个半最大反应（EC50）所需的浓度约为12微米。


图2
自动图像采集和分析，转基因斑马鱼的胚胎。 （一）二甲基亚砜车辆处理TG（dusp6：d2eGFP）30hpf ^PT6胚胎。 （二）与20μMBCI显示处理过的转基因胚胎中GFP的表达增加。 （三）从胚胎图像（a）在运行规则集Definiens的头部找到GFP表达。橙色点表示该软件的措施GFP的强度。 （四）从胚胎图像（b）在运行规则集Definiens公司在头部发现GFP的表达。橙色点表示该软件的措施GFP的强度。请注意，规则集能够找到处理后的胚胎中GFP表达的扩大面积。

讨论

限制的斑马鱼化工屏幕的吞吐量的一个主要因素是缺乏系统的成像和分析过程的96孔板的方法。由于是复杂的多细胞生物体的图像，低对比度和性质异构，现有的图像分析算法故障检测和量化机体内部的具体结构。因此，大多数公布的斑马鱼化工屏幕涉及视觉由专门人员检查整个过程中个别井。这通常可以防止的数值读数生成和屏幕图像和数据的完整归档。此外，评价手册消除图像为基础的筛查，即能力，画面表现进行回顾性分析，研究表型的变化，没有甄别运动（如毒性或发育缺陷）的主要重点和跨的几个关键优势参考过去或将来的屏幕上使用相同的化合物库的筛选数据。

在这份报告中，我们强调和斑马鱼的胚胎在多孔板自动成像分析的方法，无需用户干预。 ^PT6胚胎在96孔板，并开发了一种图像分析算法基于Definiens公司的认知网络技术，量化的GFP：我们ImageXpress超激光扫描共聚焦阅读器（分子器件，位于美国加州Sunnyvale）的形象TG（d2EGFP dusp6）自动图像捕捉表达的转基因胚胎的头。该方法提供了分级响应和FGF信号的一种小分子活化剂在体内的活动量化。与epifluorescence基于ArrayScan II（Cellomics公司，匹兹堡PA）获得了类似的结果证明它是可以实现的各种市售板读者²斑马鱼胚胎的自动图像捕获。方法论的发展，自动分析多细胞生物体图像消除由人类观察者视觉得分的需要，并启用了回顾性分析，并与未来的屏幕比较的数值数据和图像的生成和归档。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine (MS222)	Sigma-Aldrich	Cat.# A-5040