Desenvolvimento de imagem automatizada e análise química para as telas de zebrafish.

Resumo

Relata-se o desenvolvimento de um sistema automatizado para geração de imagens e análise de zebrafish embriões transgênicos em placas de vários poços. Isso demonstra a capacidade de medir os efeitos dose-dependente de uma pequena molécula, BCI, na expressão do gene Fator de Crescimento de Fibroblastos repórter e fornecer tecnologia para o estabelecimento de high-throughput telas química zebrafish.

Resumo

Nós demonstramos a aplicação de baseada em imagem de alta teor de metodologia de triagem (HCS) para identificar as moléculas pequenas que podem modular a via de FGF / RAS / MAPK em embriões de peixe-zebra. O embrião do zebrafish é um sistema ideal para in vivo telas de alto conteúdo químico. O embrião de 1 dia de idade é de aproximadamente um milímetro de diâmetro e pode ser facilmente dispostas em placas de 96 poços, um formato padrão para a triagem de alto rendimento. Durante o primeiro dia de desenvolvimento, os embriões são transparentes com a maioria dos principais órgãos presentes, possibilitando a visualização da formação de tecido durante a embriogênese. A automação completa de telas química zebrafish ainda é um desafio, no entanto, particularmente no desenvolvimento de aquisição de imagem e análise automatizada. Nós já gerou uma linha de repórter transgênico que expressa a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle da atividade FGF e demonstraram sua utilidade em telas de química

Protocolo

1) Configure acasalamentos zebrafish e tratamento BCI.

1. Dois dias antes do tratamento, identificar Tg homozigotos do sexo masculino (dusp6: d2eGFP) ^PT6 zebrafish e coloque individualmente em tanques de acasalamento ^1. Adicionar separador e um tipo selvagem de peixe * AB feminino e deixar em gaiolas de acasalamento durante a noite.
2. Na manhã seguinte, remover o separador, e coletar embriões após 1 hora. Transferência de embriões para pratos 100mm com E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), solução e incubar a 28 ° C por 6 horas. Remover mortos e não fertilizados embriões, adicione solução E3 fresco, e incubar durante a noite.
3. Ordenar embriões transgênicos para a fase similar (24hpf) e expressão de GFP uniforme. Embriões matriz individualmente em cada poço de uma placa de 96 poços.
4. Remoção da solução E3 excesso com uma micropipeta. Adicionar 200μl de solução E3 com uma pipeta multi-canal em cada poço.
5. Adicionar os seguintes compostos, conforme listado:
   
   

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   A

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   B

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   C

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   D

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   E

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   F

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   G

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mM)

   2μl DMSO

   H

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   Concentrações finais são 1 Hm, 5m, 10μM, 20Hm, 25μM BCI em DMSO 1%. Cobrir a placa em papel alumínio e incubar por 6 horas a 28 ° C.

2) imagem automática de placas de 96 poços e análise.

1. Adicionar 10μl de tricaina (0.61mM) a cada poço para anestesiar embriões 30hpf.
2. Carga em placa Molecular Devices Imagexpress Ultra.
3. Software open Metaxpress. Escolher uma configuração com um objetivo de 4x e diâmetro máximo de pinhole, configure a laser autofocus para detectar placa de fundo, e determinar o melhor plano Z para detectar regiões de interesse. Adquirir imagens de excitação / emissão de comprimentos de onda de 488/525 nm (GFP). Definir scan área como um único site de 2000x2000 pixels (4 x 4 mm) sem binning. Configure potência do laser e ganho de tal forma que as regiões mais brilhantes nas imagens do controlo positivo não saturar. Confirmar a aquisição da imagem adequada em vários poços de controlo positivo e negativo.
4. Start scan prato. O instrumento irá automaticamente adquirir imagens de todos os poços e arquivá-los em um banco de dados SQL server.
5. Upload de imagens em Definiens desenvolvedor usando o módulo de aplicação Cellenger e um filtro de importação que reconhece o formato de imagem e estrutura do arquivo gerado pelo Dispositivos Imagexpress Molecular plataforma Ultra.
6. Processar imagens com um algoritmo projetado Cognição personalizado Technology Network (também chamado de um conjunto de regras). O algoritmo, que personalizado, desenvolvido com base em um conjunto de regras recentemente publicado ^2, foi projetado para automaticamente identificar embrião, gema, e na cabeça, e de quantificar o brilho ea área de GFP-estruturas expressar cabeça. Wells em que nenhum embrião é detectado ou quando a cabeça não pode ser inequivocamente atribuída (por exemplo, com toxicidade composto de alta ou fora de foco imagens) são excluídos da análise. Configure o algoritmo usando várias imagens controle negativo (veículo tratados) e imagens de controle positivo (BCI tratados), tais que a cabeça ea gema são corretamente identificados em ambos. Definir uma "cabeça estruturas" limiar de detecção em múltiplos de intensidade média de gema, até a detecção de estruturas de cabeça brilhantes partidas de observação visual. Definir parâmetros para exportação. Neste exemplo, o parâmetro mais informativo foi o brilho total integrada de GFP-positivos regiões dentro da cabeça, a seguir denominado "total cabeça brilho estruturas" (Figura 1).
   
   
   Figura 1
   Gráfico depicitng os efeitos dose-dependente da BCI na GFP expressão em embriões transgênicos.
7. Executar o algoritmo em todas as imagens usando a placa integrada agendador de tarefa. O software Definiens usa computação distribuída em vários processadores ("motores"), permitindo análise simultânea de várias imagens. O algoritmo calcula medidas numéricas com base nos resultados da análise de imagens, que são guardados no banco de dados juntamente com uma cópia da imagem processada, com a análise aplicada.

Resultados representativos:

Depois de todas as imagens são analisadas, os dados podem ser visualizados dentro Cellenger ou exportados para o software de terceiros (Excel, GraphPad Prism) para posterior análise e representação gráfica. A Figura 2 mostra arquivados digitalizar imagens a partir de um veículo e um tratado BCI-bem tratados, com e sem CNT análise aplicados. Figura 1 documenta um efeito dose-dependente da BCI na expressão do gene GFP repórter em Tg (dusp6: d2EGFP) ^PT6 embriões. A concentração necessária para provocar uma resposta meia máxima (EC50) foi de aproximadamente 12 mM.


Figura 2
Captura de imagem e análise automatizada de embriões zebrafish transgênicos. (A) veículo DMSO tratados Tg (dusp6: d2eGFP) ^PT6 embrião no 30hpf. (B) embriões transgênicos tratados com 20Hm mostrar BCI aumentos na expressão GFP. (C) Imagem do embrião a partir de (A) após a execução Definiens conjunto de regras para encontrar expressão GFP na cabeça. Manchas laranja denotam onde o software mede a intensidade GFP. (D) Imagem do embrião a partir de (B) após a execução Definiens conjunto de regras para encontrar expressão GFP na cabeça. Manchas laranja denotam onde o software mede a intensidade GFP. Note-se que o conjunto de regras foi capaz de encontrar um espaço alargado de expressão GFP no embrião tratado.

Discussão

Um fator importante limitar a taxa de telas química zebrafish é a falta de metodologia para processar sistematicamente placas de 96 poços para a imagem latente e análise. Porque as imagens de organismos multicelulares são contraste, complexos de baixa, e de natureza heterogénea, algoritmos de análise de imagem existentes não conseguem detectar e quantificar estruturas específicas dentro do organismo. A maioria das telas química publicada zebrafish, portanto, envolverá a análise visual de poços individuais por pessoal dedicado durante todo o procedimento. Isso geralmente impede a geração de leituras numéricas e um completo arquivo de imagens da tela e dados. Além disso, avaliação manual elimina várias vantagens importantes da imagem baseada em triagem, ou seja, a capacidade de realizar análises retrospectivas de desempenho da tela, para examinar as mudanças fenotípicas que não eram o foco principal da campanha de triagem (por exemplo, toxicidade, ou defeitos de desenvolvimento) e para cruzar -dados de referência de triagem com telas de passado ou futuro usando a biblioteca mesmo composto.

Neste relatório, destacam-se metodologia para geração de imagens e análise automatizada de embriões em placas de zebrafish vários poços sem intervenção do usuário. Nós captura de imagem automatizados em um laser Ultra ImageXpress varredura confocal leitor (dispositivos Molecular, Sunnyvale, CA) para a imagem Tg (dusp6: d2EGFP) ^PT6 embriões em 96 placas bem e desenvolveu um algoritmo de análise de imagem com base em Rede Definiens "Cognição Tecnologia que GFP quantificados expressão nas cabeças dos embriões transgênicos. O método fornecido respostas classificados e quantificados a atividade in vivo de uma pequena molécula ativador da FGF sinalização. Resultados semelhantes foram obtidos com o epifluorescência baseado ArrayScan II (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) documenta que é possível implementar a captura de imagem automatizado de embriões zebrafish em uma variedade de leitores de placas disponíveis comercialmente ^2. O desenvolvimento de metodologia para analisar automaticamente imagens organismo multicelular eliminou a necessidade de marcar visual por um observador humano e permitiu a geração e arquivamento de dados numéricos e imagens para análise retrospectiva e comparações com telas futuro.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine (MS222)	Sigma-Aldrich	Cat.# A-5040