zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

요약

우리는 multiwell 플레이트에 zebrafish 배아 유전자 변형의 자동 이미징 및 분석을위한 시스템의 개발을보고합니다. 이것은 Fibroblast 성장 팩터 리포터 유전자의 표현에 작은 분자, BCI의 복용 부양 효과를 측정하고 높은 처리량 zebrafish 화학 화면 설립을위한 기술을 제공하는 능력을 보여줍니다.

초록

우리는 zebrafish의 배아에서 FGF / RAS / MAPK 경로를 조절 수있는 작은 분자를 식별하는 이미지 기반의 높은 콘텐츠 심사 (HCS) 방법론의 응용 프로그램을 보여줍니다. zebrafish 배아는 생체내 높은 컨텐츠 화학 화면에서 이상적인 시스템입니다. 1 일 이전 난자는 직경이 약 1mm이고 쉽게 96 - 웰 플레이트, 높은 처리량 검사를위한 표준 형식으로 못하였 느니라 수 있습니다. 개발의 첫날 동안 배아 따라서 embryogenesis 동안 조직 형성의 시각화를 가능하게 현재 주요 기관의 대부분 투명하고 있습니다. zebrafish 화학 화면의 완벽한 자동화는 특히 자동화된 이미지 수집 및 분석의 개발에, 그러나, 여전히 도전입니다. 우리는 이전에 FGF 활동의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 유전자 변형 기자 라인을 생성하고 화학 화면에서 유틸리티를 보여주

프로토콜

1) zebrafish matings 및 BCI 처리를 설정합니다.

1. 개별적으로 짝짓기 탱크 ^{하나에 pt6} zebrafish 및 장소 : 이틀 전에 치료, homozygous 남성 TG를 (d2eGFP dusp6) 식별합니다. 구분 및 야생 타입 AB * 여성의 물고기를 추가하고 야간 짝짓기 새장에 둡니다.
2. 다음날 아침은 구분 기호를 제거하고 1 시간 뒤에 배아를 수집합니다. E3 (5 MM NaCl, 0.17 MM KCl, 0.33 MM CaCl2, 0.33 MM MgSO4), 6 시간 동안 28 ° C에서 솔루션과 부화와 100mm 요리 배아를 전송합니다. 죽은 제거하고 배아를 unfertilized, 신선한 E3 솔루션을 추가하고 밤새 품어.
3. 유사한 단계 (24hpf)과 균일한 GFP 발현을위한 유전자 변형 배아를 정렬하십시오. 96 - 웰 플레이트의 각 우물에 개별적으로 배열 배아.
4. micropipette과 초과 E3 솔루션을 제거합니다. 각 우물에 멀티 채널 pipettor와 E3 솔루션의 200μl를 추가합니다.
5. 로 표시된 다음과 같은 화합물을 추가합니다 :
   
   

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl DMSO

   B

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl DMSO

   C

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl DMSO

   D

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl DMSO

   E

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl DMSO

   F

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl DMSO

   G

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl DMSO

   H

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl BCL (0.1mM)

   2μl BCL (0.5mM)

   2μl BCL (1mM)

   2μl BCL (2mM)

   2μl BCL (2.5mM)

   2μl DMSO

   최종 농도는 1 %의 DMSO에 5μM, 10μM, 20μM, 25μM BCI 1μM 있습니다. 알루미늄 호일의 플레이트 커버 28 6 시간 동안 품어 ° C.를

96 - 웰 플레이트 및 분석 2) 자동 이미징.

1. 30hpf 배아를 마취 각 잘하는 tricaine (0.61mM)의 10μl를 추가합니다.
2. 분자 장치 Imagexpress 울트라에 플레이트를로드합니다.
3. 오픈 Metaxpress 소프트웨어. 4X 객관적이고 최대 핀홀 직경과 구성을 선택, 레이저 오토포커스는 접시 바닥을 감지하도록 구성하고, Z - 비행기의 관심 영역을 감지하는 최적의 결정합니다. 525분의 488 NM (GFP)의 여기 / 발광 파장의 형상을 습득. 노 비닝과 2000x2000 픽셀 (4 X 4mm)의 단일 사이트로 영역을 스캔 설정합니다. 레이저 전원을 구성하고 포화하지 긍정적인 컨트롤 이미지 같은 것을 밝은 지역을 습득합니다. 몇 가지 긍정적이고 부정적인 제어 우물에 적절한 이미지 수집을 확인합니다.
4. 판 검사를 시작합니다. 악기는 자동으로 모든 우물 및 아카이브들을 SQL 서버 데이터베이스에서에서 이미지를 획득합니다.
5. Cellenger 응용 프로그램 모듈과 분자 장치 Imagexpress 울트라 플랫폼에 의해 생성된 이미지 포맷 및 파일 구조를 인식 가져오기 필터를 사용하여 Definiens 개발자에 이미지를 업로드합니다.
6. 사용자 정의 설계 인식 네트워크 기술 알고리즘 (또한 ruleset 칭했다)과 프로세스 이미지. 우리가 정의가 최근에 출판된 ruleset ^2를 기반으로 개발된 알고리즘은, 자동으로 배아, 난황, 그리고 머리를 식별하고, GFP - 표현 헤드 구조의 밝기와 영역을 계량하기 위해 설계되었습니다. 더 배아가 감지되지되는거나 머리가 unambiguously (예를 들어, 초점 이미지의 높은 화합물 독성 또는 밖으로)를 할당할 수 없습니다 어디 웰스는 분석에서 제외됩니다. 몇 가지 부정적인 통제 이미지 (차량 취급)와 긍정적인 이미지 제어 (BCI이 대접) 머리와 노른자가 올바르게 모두에서 확인할 수 있습니다 그러한 사용하여 알고리즘을 구성합니다. 밝은 머리 구조의 검색이 시각적 관찰과 일치하는 때까지 의미 노른자 강도의 배수으로 "머리 구조"검출 임계값을 설정합니다. 수출에 매개 변수를 정의합니다. 이 예제에서, 가장 유익한 매개 변수 이하 "전체 헤드 구조의 밝기"(그림 1) 칭했다 머리 이내 GFP 양성 지역의 전체 통합 밝기되었습니다.
   
   
   그림 1
   그래프는 유전자 변형 배아에서 GFP 표현에 BCI의 복용량에 의존 효과를 depicitng.
7. 통합 작업 스케줄러를 사용하여 모든 플레이트 이미지 알고리즘을 실행합니다. Definiens 소프트웨어는 여러 개의 이미지를 동시에 분석함으로써 여러 프로세서 ( "엔진")에서 분산 컴퓨팅을 사용합니다. 알고리즘 적용 분석 처리 이미지의 사본과 함께 데이터베이스에 저장되는 이미지 분석,의 결과에 따라 수치 조치를 계산합니다.

대표 결과 :

모든 이미지는 분석 후 데이터 Cellenger 이내 시각하거나 추가 분석 및 그래픽 표현에 대한 타사 소프트웨어 (엑셀, GraphPad 프리즘)에 수출하고 있습니다. 그림 2 보여줍 대우 자동차에서 스캔 이미지를 보관하고 적용과 CNT 분석없이 잘 BCI - 대우. 그림 1 문서 TG에서 GFP 리포터 유전자 발현 (dusp6 : d2EGFP)에 BCI의 복용량에 의존 효과 ^pt6 배아. 반 최대한 응답 (EC50)을 이끌어내는 데 필요한 농도는 약 12​​ μm의되었습니다.


그림 2
유전자 변형 zebrafish의 배아의 자동 이미지 캡처 및 분석. 30hpf에서 ^pt6 배아 (A) DMSO 차량은 TG를 (d2eGFP dusp6) 치료. (B) 20μM BCI 쇼 취급 트렌스 제닉 배아는 GFP 발현 증가. 배아의 (C) 이미지에서 (A) 머리에 GFP 발현을 찾을 수 ruleset Definiens를 실행한 후. 오렌지 명소 소프트웨어가 GFP 강도를 측정 어디 상징. (D) 배아의 이미지에서 (B) 머리에 GFP 발현을 찾을 수 ruleset Definiens를 실행한 후. 오렌지 명소 소프트웨어가 GFP 강도를 측정 어디 상징. ruleset은 치료 배아에서 GFP의 표현의 확장 영역을 찾을 수 있다고합니다.

토론

zebrafish 화학 화면의 처리량을 제한하는 주요 요인은 체계적으로 처리 이미징 및 분석을위한 96 - 웰 플레이트에 방법론의 부족이다. 다세포 생물의 이미지가 복잡하고, 낮은 콘트라스트, 그리고 자연의 이기종 때문에, 기존의 영상 분석 알고리즘은 유기체 내의 특정 구조를 감지하고 수치 실패합니다. 대부분의 출판 zebrafish 화학 화면 따라서 절차 전반에 걸쳐 전담 요원에 의해 개인 우물의 영상 검사를 포함하고 있습니다. 이것은 일반적으로 수치 설치 했어요의 생성 및 화면 이미지와 데이터의 보관 완전히 방지합니다. 또한, 수동 평가 즉 이미지 기반의 심사, 화면 성능의 회고 분석을 수행하기 위해 심사 캠페인 (예 : 독성 또는 발달 결함)의 주요 초점이되지 않은 phenotypic 변경 사항을 검토하고 교차하는 기능의 몇 가지 주요 장점을 제거 같은 화합물 라이브러리를 사용하여 과거 또는 미래 스크린 - 참조 검사 데이터입니다.

이 보고서에서 우리는 사용자의 개입없이 multiwell 플레이트에 zebrafish 배아의 자동 이미징 및 분석을위한 방법론을 강조. 96 잘 접시에 ^pt6 배아 및 Definiens '인식 네트워크 기술되는 계량 GFP에게 기반으로 이미지 분석 알고리즘을 개발 : 이미지 TG (d2EGFP dusp6)에 공촛점 리더를 (분자 장치, 서니 베일, CA) 스캔 ImageXpress 울트라 레이저에서 우리는 자동 이미지 캡처 유전자 변형 배아의 머리에 표현. 방법은 등급 반응을 전달하고 작은 분자 FGF 신호의 활성의 생체내 활동에 계량. 비슷한 결과는 그것이 상용 판 독자의 다양한 ² zebrafish 배아의 자동 이미지 캡처를 구현 가능하다 문서화 epifluorescence 기반 ArrayScan II (Cellomics 주식 회사, 피츠버그 PA)로 획득했다. 자동으로 다세포 생물 이미지를 분석하는 방법론의 개발은 인간의 관찰자에 의해 시각 점수에 대한 필요성을 제거하고 미래의 스크린 회고 분석 및 비교를위한 수치 데이터 및 이미지의 생성 및 보관을 활성화.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine (MS222)	Sigma-Aldrich	Cat.# A-5040