Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

Özet

Biz zebrafish transgenik embriyolar multiwell plakaları otomatik olarak görüntüleme ve analiz için bir sistem geliştirme raporu. Fibroblast Büyüme Faktörü muhabiri gen ekspresyonu üzerine küçük bir molekül, BCI, doza bağımlı etkileri ölçmek ve yüksek verimli zebrafish kimyasal ekranlar kurulması için teknoloji yeteneğini göstermektedir.

Özet

Biz zebrafish embriyolar FGF / RAS / MAPK yolağı modüle küçük moleküller tanımlamak için görüntü tabanlı yüksek içerik tarama (HCS) metodolojisi uygulama göstermektedir. Zebra balığı embriyosu, in vivo yüksek içerikli kimyasal ekranlar için ideal bir sistem. 1 gün eski embriyo yaklaşık 1 mm çapında ve 96-kuyu plakalar, yüksek verim tarama için standart bir format içine kolayca dizilmiş olabilir. Gelişimin ilk gününde, embriyolar, böylece embriyogenez sırasında doku oluşumu görselleştirme sağlayan en önemli organların en şeffaf. Özellikle otomatik görüntü toplama ve analiz geliştirme zebrafish kimyasal ekranların tam otomasyon, ancak hala bir sorundur. Biz daha önce FGF aktivite kontrolü altında yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eden transgenik muhabir hattı oluşturulmuş ve kimyasal ekranları kendi programını gösterdi

Protokol

1) Zebra balığı çiftleşmelerin ve BCI tedavi ayarlayın.

1. Bireysel çiftleşme tankları ^{1'e pt6} Zebra balığı ve yeri: İki gün önce tedavi, homozigot erkek Tg (d2eGFP dusp6) tanımlamak. Ayırıcı ve vahşi bir türü AB * dişi balık ekleyin ve çiftleşme kafesleri bir gecede terk.
2. Ertesi sabah ayırıcı kaldırmak ve 1 saat sonra embriyolar toplamak. E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4), çözüm ve 6 saat boyunca 28 ° C'de inkübe 100mm yemekleri embriyo transferi. Ölü kaldırın ve gübresiz embriyolar, taze E3 bir çözüm ekleyin ve bir gece inkübe edin.
3. Benzer evre (24hpf) ve uniform GFP ifade transgenik embriyolar sıralayın. 96 plaka her kuyuya ayrı ayrı Dizi embriyolar.
4. Mikropipet aşırı E3 çözüm çıkarın. E3 çözüm her kuyuya bir çok kanallı pipet ile 200μl ekleyin.
5. Olarak listelenen aşağıdaki bileşikler ekle:
   
   

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   A

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl DMSO

   B

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl DMSO

   C

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl DMSO

   D

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl DMSO

   E

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl DMSO

   F

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl DMSO

   G

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2,5 mM)

   2μl DMSO

   H

   2μl DMSO

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl BCL (0.1mm)

   2μl BCL (0.5mm)

   2μl BCL (1mm)

   2μl BCL (2mm)

   2μl BCL (2.5mm)

   2μl DMSO

   Final konsantrasyonları, 1% DMSO 5μM, 10μM, 20μM, 25μM BCI 1 mikrona kadar. Kapak ve alüminyum folyo levha az 6 saat boyunca inkübe 28 ° C

2) 96-kuyucuğu ve analiz Otomatik görüntüleme.

1. 30hpf embriyolar uyutmak için her iyi tricaine (0.61mM) 10μl ekleyin.
2. Moleküler Cihazlar Imagexpress Ultra içine plaka yükleyin.
3. Açık Metaxpress yazılım. 4x amacı ve maksimum iğne deliği çapı ile bir yapılandırma seçin, lazer otofokus plaka alt algılamak için yapılandırmak ve Z-düzleminde ilgi bölgeleri tespit etmek için en iyi belirlemek. 488 / 525 nm (GFP) uyarma / emisyon dalga boylarında görüntüler elde. Hiçbir binning ile 2000x2000 piksel (4 x 4 mm), tek bir site olarak alan tarama ayarlayın. Lazer güç yapılandırma ve pozitif kontrol görüntüler gibi parlak bölgelerde elde doyurabilecek değil. Birçok pozitif ve negatif kontrol kuyuları düzgün bir görüntü elde etme onaylayın.
4. Plaka tarama başlatın. Cihaz, otomatik olarak tüm kuyuları ve arşiv onları bir SQL Server veritabanı görüntüleri kazanacaklardır.
5. Definiens Geliştirici Cellenger uygulama modülü ve Moleküler Aygıtlar Imagexpress Ultra platformu tarafından oluşturulan görüntü formatı ve dosya yapısını tanıyan bir ithalat filtre kullanarak resim gönderin.
6. Özel olarak tasarlanmış bir Biliş Ağ Teknolojisi algoritma (aynı zamanda bir kural setleri olarak adlandırılır) ile işlem görüntüler. Biz özel kısa bir süre önce yayınlanan kuralkümesi ² dayalı geliştirilen algoritma, embriyo, yumurta sarısı, ve baş otomatik olarak tespit etmek ve kafa yapıları GFP-ifade parlaklık ve alanını ölçmek için tasarlanmıştır . Embriyo tespit edildiği veya kafası net bir şekilde atanan (örneğin, odak görüntüleri yüksek bileşik toksisite veya dışarı) olamaz nerede Wells analiz dışında tutulmuştur. Algoritma kullanarak birkaç negatif kontrol görüntüler (araç tedavi) ve pozitif kontrol görüntüler (BCI tedavi) baş ve yumurta sarısı, hem de doğru tanımlanmış olması gibi yapılandırın. Parlak kafa yapılarının tespiti görsel gözlem eşleşen kadar ortalama sarısı yoğunluğu katları olarak bir "kafa yapıları" algılama eşiği ayarlayın. Ihracat parametreleri tanımlayın. Bu örnekte, en bilgilendirici parametre bundan sonra "toplam kafa yapıları parlaklık" (Şekil 1) olarak adlandırılan başın içinde GFP pozitif bölgelerde, toplam entegre parlaklık oldu.
   
   
   Şekil 1
   Grafik transgenik embriyolarda GFP ifade BCI doza bağımlı etkileri depicitng.
7. Algoritma kullanan tüm entegre iş scheduler plakası görüntüleri çalıştırın. Definiens yazılım aynı anda birden fazla görüntü analizi sağlayan dağıtılmış bilgi işlem, birkaç işlemci ("motorları") kullanır. Algoritması uygulanan analizi ile işlenmiş görüntünün bir kopyası ile birlikte veritabanına kaydedilir görüntü analizi, elde edilen sonuçlar dayalı sayısal ölçümler hesaplar.

Temsilcisi Sonuçlar:

Sonra tüm görüntüleri analiz, veri Cellenger içinde görüntülenir ya da daha fazla analiz ve grafiksel gösterimi için üçüncü parti yazılımlar (Excel, GraphPad Prism) ihraç. Şekil 2 tedavi edilen bir araç tarama görüntüler arşivlenir ve iyi uygulanmış ve CNT analiz olmadan BCI-tedavi bir. Şekil 1 belgeleri Tg GFP muhabiri gen ekspresyonu (dusp6: d2EGFP) BCI, doza bağımlı bir etkisi ^pt6 embriyolar. Yarım maksimum yanıt (EC50) ortaya çıkarmak için gerekli konsantrasyonu yaklaşık 12 mcM idi.


Şekil 2
Transgenik zebrafish embriyoların Otomatik görüntü yakalama ve analizi. 30hpf ^pt6 embriyo: (A) DMSO araç Tg (d2eGFP dusp6) tedavi. (B) 20μM BCI gösterisi ile tedavi edilen transgenik embriyolar GFP ifade artırır. (C) embriyo Görüntü (A) baş GFP ifade bulmak için kural setleri Definiens çalıştırdıktan sonra. Turuncu noktalar yazılım GFP yoğunluğunu ölçen göstermektedir. (D) embriyo Görüntü, (B) baş GFP ifade bulmak için kural setleri Definiens çalıştırdıktan sonra. Turuncu noktalar yazılım GFP yoğunluğunu ölçen göstermektedir. Kuralkümesi tedavi edilen embriyo GFP ifade genişletilmiş bir alan bulmak mümkün olduğunu unutmayın.

Tartışmalar

Zebrafish kimyasal ekranların verimini sınırlayan en önemli faktör, sistematik bir süreç görüntüleme ve analiz için 96-kuyucuğu metodoloji eksikliği. Çok hücreli organizmalarda görüntüleri karmaşık, düşük kontrast ve heterojen doğası nedeniyle, mevcut görüntü analizi algoritmaları organizma içinde özel yapıları tespit etmek ve ölçmek için başarısız olur. En yayımlanan zebrafish kimyasal ekranları bu nedenle işlem boyunca özverili personeli tarafından bireysel kuyuların gözle muayene içerir. Bu genellikle sayısal okuma üretim ve tam bir ekran görüntüleri ve veri arşivleme önler. Ayrıca, elle değerlendirme, yani görüntü tabanlı tarama, ekran performansı retrospektif analizler yapmak için tarama kampanyası (örneğin, toksisite ya da gelişimsel kusurlar) birincil odak fenotipik değişiklikleri incelemek ve çapraz yeteneği çok önemli avantajları ortadan kaldırır geçmiş veya gelecekteki ekranlar ile aynı bileşik kitaplığı kullanılarak referans tarama verileri.

Bu yazıda, kullanıcının müdahalesine gerek kalmadan zebrafish embriyoların multiwell plakalar otomatik görüntüleme ve analiz için metodoloji vurgulayın. Biz 96 kuyucuğu ^pt6 embriyo ve Definiens Biliş Ağ Teknolojisi ki sayısal GFP dayalı bir görüntü analizi algoritması geliştirilen görüntü Tg (d2EGFP dusp6): konfokal okuyucu (Moleküler Aygıtlar, Sunnyvale, CA) tarama ImageXpress Ultra lazer otomatik görüntü yakalama transgenik embriyoların başkanları ifade. Yöntemi kademeli yanıtları teslim ve FGF sinyalizasyon küçük bir molekül aktivatör in vivo aktivite nicel. Zebrafish embriyoların ^2, piyasada bulunan plaka okuyucuları çeşitli otomatik görüntü yakalama uygulamak mümkün olduğunu belgeleyen Epifloresans tabanlı ArrayScan II (Cellomics A.Ş., Pittsburgh, PA) ile benzer sonuçlar elde edildi . Çok hücreli organizma görüntüler otomatik olarak analiz etmek için metodoloji geliştirilmesi, insan bir gözlemci tarafından görsel skorlama için ihtiyaç ortadan nesil ve gelecek ekranları ile retrospektif analizi ve karşılaştırmalar için sayısal veri ve görüntü arşivleme etkin.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine (MS222)	Sigma-Aldrich	Cat.# A-5040