货物装载到驱动蛋白供电分子梭

摘要

滑翔表面坚持kinesin的马达蛋白可以作为一个纳米级的运输系统的功能化微管组成的分子航天飞机。在这里，一个典型的航天飞机系统的组装描述。

摘要

细胞进化复杂的分子机器，如驱动蛋白马达蛋白和微管丝，积极支持细胞内的货物运输。而动蛋白尾巴域结合各种货物，动蛋白的头域利用的化学能储存在ATP分子沿着微管晶格步骤。长的，僵硬的微管作为长距离的细胞内运输的轨道。

这些电机和长丝，也可以受雇于微型合成环境中，作为^分子航天飞机1的组成部分。在经常使用的设计，马达驱动蛋白锚定通过跟踪它们的尾巴表面，载货元素，这些电机推进服务和功能化微管。这些航天飞机可装载货物，利用生物素链亲和素之间的强和选择性结合。 （生物素标记的微管蛋白，链霉亲和素和生物素的货物）关键部件均为市售。

大厦的经典倒活力测定^2，分子航天飞机的建设是在这里详细说明。驱动蛋白马达蛋白被吸附到表面覆膜与酪蛋白，生物素标记的微管蛋白聚合微管，坚持动蛋白，随后与罗丹明标记的链霉涂层。 ATP的浓度保持在subsaturating浓度来实现微管滑行速度的最佳装货^3。最后，生物素，荧光标记的纳米球是货物补充。纳米微粒的附着微管作为滑翔坚持到表面的微管和纳米球之间的碰撞的结果。

该协议可以很容易地修改，加载，如生物素化DNA，量子^点 5或^通过 4-6生物素化抗体的抗原种类繁多的各种货物。

研究方案

1）缓冲液和试剂

这些解决方案应提前做好准备，并存储在方便大小等分。等份应包含足够的解决方案一个典型的实验和新鲜等份应为每一个蠕动检测。也提到了以下协议的储存条件和典型等份大小。

1。 BRB80缓冲区，（80毫米的管道，1毫米氯化镁_2，1毫米EGTA（DD）在去离子蒸馏水水，由氢氧化钾调整pH至6.9）

• 100毫升的0.5 M EGTA股市日水的解决方案。 7.0使用2 M NaOH溶液调节pH值。
• 一个100毫升的1 M MgCl _2的股票在DD水的解决方案。高压灭菌器的解决方案。
• 添加24.2克的管道和日水约800毫升3.1克KOH颗粒，搅拌至溶解。调节pH值至6.9，使用1 M KOH溶液。加入2毫升0.5 M的EGTA原液和1毫升1 M MgCl _2的原液。用dd水1000毫升的体积。
• 分装成50毫升猎鹰管和冻结在-20 ° C以供将来使用。目前正在使用的BRB80管可在4 ° C或在室温下储存。

2。氯化镁，氯化镁_2（100毫米日水）

• 中日水稀释至终浓度达到100毫米。
• 分装到0.5毫升离心管和储存在-20 ° C（10μL体积），以供将来使用

3。 5' -三磷酸鸟苷二钠，GTP（25毫米，用NaOH调整至7日水，pH值）

• 称量和溶解在DD水和2 M NaOH溶液的pH值调整到7。
• 验证通过测量在260 nm紫外吸收的浓度。 （11.7 × 103米^-1厘米^-1使用的消光系数）。
• 分装（10μL体积）到0.5毫升离心管，在-20 ° C储存供日后使用。

4。二甲基亚砜，二甲基亚砜

• 分装（10μL体积）到0.5毫升离心管，在-20 ° C储存供日后使用。

5。紫杉醇（1毫米在DMSO）

• 称量并溶于通风柜下在DMSO终浓度达到1毫米。
• 分装（20μL体积）到0.5毫升离心管，在-20 ° C储存供日后使用。

6。 D -（+）葡萄糖（2日水的中号）

• 称，日水溶解，终浓度达到了2米
• 分装（20μL体积）到0.5毫升离心管，在-20 ° C储存供日后使用。

7。葡萄糖氧化酶，（2 mg / ml的BRB80）

• 溶解在BRB80实现终浓度为2毫克/毫升。
• 分装（20μL体积）到0.5毫升离心管，在-20 ° C储存供日后使用。

8。二硫苏糖醇，DTT（1日水的中号）

• 在DD水溶解通风柜下终浓度达到1米的
• 分装（20μL体积）到0.5毫升离心管，在-20 ° C储存供日后使用。

9。过氧化氢酶（0.8 mg / ml的BRB80）

• 在BRB80溶解在至少2个阶段实现终浓度为0.8毫克/毫升。确定在每个阶段的浓度，并通过测量在276纳米和406纳米（使用3.1 ^{× 10 5}米^-1厘米-1在276纳米和2.2 ^{× 10 5}米^-1厘米-1在406 nm处的消光系数的紫外吸收该方程为A = CL）。
• 分装（20μL体积）到0.5毫升离心管，在-20 ° C储存供日后使用。

10。 5' -三磷酸腺苷，ATP（100毫米MgCl _2的 100MM）

• 准备在DD水原液的100毫米氯化镁_2。称取干粉，在这股溶液溶解至终浓度达到100毫米。
• 验证通过测量在260 nm紫外吸收的浓度。 （15.4 x 10 ^3米-1厘米^-1使用的消光系数） 。
• 分装（20μL体积）到0.5毫升离心管，在-20 ° C储存供日后使用。

11。酪蛋白溶液（20 mg / mL的酪蛋白在BRB80）

• 约3克酪蛋白添加到30毫升50毫升猎鹰管DD水。约1小时的旋涡发展，直到厚厚的一致性解决方案。
• 在约15000克离心30分钟。通过0.5微米和0.2微米针头式过滤器的过滤上清。
• 确定上清的浓度，通过测量紫外吸收在280 nm（使用0.67 ^毫升毫克^-1厘米-1的消光系数）。稀释到20毫克/毫升在BRB80。
• 分装（20微升量）0.5毫升离心管，在-20 ° C储存供日后使用。

2）标准溶液

这些准备一天的实验，实验结束后，应将其丢弃。准备1毫升每个。

1。 BRB80CS0.5

• 稀BRB80酪蛋白溶液中的终浓度为0.5 mg / mL和存储在冰。这个解决方案是引入流通池之前动蛋白和表面吸附后保留动蛋白的活动。

2。 BRB80CA

• 准备在0.2 mg / mL的酪蛋白和1毫米ATP BRB80和存放在冰。驱动蛋白是进一步稀释使用这个解决方案引入到流通池之前。

3。 BRB80T

• 稀紫杉醇BRB80的终浓度为10微米，在室温下存储解决方案。这个解决方案是用于稳定微管。

4。 BRB80CT

• 准备10μM紫杉醇和0.2 mg / mL的酪蛋白在BRB80并在室温下保存。这是使用抗淬灭和微管的解决方案，以进一步准备。

5。 BRB80AF

• 准备20毫米D -葡萄糖，20μg/ mL的葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶8微克/毫升，10 mM的数码地面电视，和20μMATP在BRB80CT并在室温下保存。这个解决方案是使用稀释的链霉亲和微球和“洗出”流细胞多余的链霉。 kinesin的速度可以控制，通过调整在此解决方案中的ATP浓度。

3）驱动蛋白的制备

• 表达一种动蛋白组成的野生型，全长果蝇动蛋白重链和C -末端在大肠杆菌中的His - tag的构造和净化使用Ni - NTA柱^6。
• 等份（10μL）0.5毫升离心管中，并储存于-80 ° C供日后使用。活跃在这些等分动蛋白浓度约200海里。
• 对于一个典型的实验，淡化kinesin的解决方案，在BRB80CA 20倍。标签KIN20在冰上和存储解决方案。

4）微管的制备

• 在0.5 ml离心管中，准备25μL生长溶液：4毫米BRB80缓冲区MgCl ₂的，1毫米GTP和5％DMSO（V / V） 。
• 添加6.25μL的冻干生物素标记的微管蛋白的20微克等分的解决方案。
• 旋涡，然后放置在热浴在37 ° C时30分钟聚合。稀释100倍轻轻BRB80T和旋涡。标签的解决方案，MT100在室温和存储。
• 设为BRB80AF的MT100 10倍稀释。标签解决方案MT1000。

5）。链霉亲和纳米微球的解决方案

AlexaFluor568的标记链霉浓度在BRB80AF 100 nm的准备。标签上STV100和存储在冰上。同样，稀释5000倍微球BRB80AF解决方案。标签在冰上NS5000和存储。

6）流动池建设

构建一个流通池使用了两片玻璃双面胶带分开的盖玻片。这种流动的细胞约2厘米长，1厘米宽，高100微米，体积约20μL。解决方案是引入流动，从一个侧面，用吸管从其他邪恶了，用滤纸细胞。

7）倒含量大会

玻璃表面先涂允许动蛋白，以保留其功能后，吸附与酪蛋白。动蛋白被吸附后，微管介绍，这是由动蛋白举行。然后涂上荧光链霉微管。冲洗掉多余的链霉后，生物素化的聚苯乙烯荧光微球（直径为40纳米）进行了介绍。表面吸附固定纳米微球的碰撞与移动微管，并获得加载到他们（图1）。

下面列出的解决方案和未来的解决方案出台之前，允许的时间流的顺序。

• BRB80CS0.5，5分钟
• KIN20，5分钟
• MT1000，5分钟
• STV100，5分钟
• BRB80AF，3X
• NS5000

8）显微镜。

安装纳米微球的介绍后，立即在显微镜舞台上流动池。在这个实验中，一个Eclipse TE2000 - U荧光显微镜（尼康，梅尔维尔，纽约州）配备了一个100倍油浸物镜（NA 1.45），一个X举120灯（EXFO，安大略省，加拿大）和一个IXON EMCCD相机（ANDOR，南温莎，CT）的使用。一个FITC过滤立方体（＃48001）和TRITC过滤立方体（＃48002，色度，罗金厄姆，VT）用于图像纳米微球及微管respectively底部表面上的流动细胞。曝光时间是0.2秒，而拍摄时间是2秒。

图1。分子航天飞机的示意图 。

讨论

稍作修改，该协议已经被成功地用于各种群体组装动蛋白，微管为基础的蠕动检测。在最终蠕动解决方案的10毫米数码地面电视服务可以被替换为0.5％β-巯基乙醇。标准解决方案（BRB80AF，KIN20和MT1000）2个多小时，不应该使用。含有紫杉醇，尤其是微管的任何解决方案，不应该被放置在冰上。过度暴露于紫外线激发光损伤的功能部件，结果：流动池，微管和驱动^蛋白 8这种效应更为明显，如...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine-5’-triphosphate (ATP)	Invitrogen	A1049
Biotin tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T333
Casein	Sigma-Aldrich	C-0376
Catalase	Sigma-Aldrich	C-9322
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G-7528
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D-8779
Dithiotreitol (DTT)	Bio-Rad	161-0610
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E-4378
FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)	Invitrogen	F-8766
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G-7016
Guanosine-5’-triphosphate (GTP)	Roche Group	106399
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	63069
Paclitaxel (Taxol)	Sigma-Aldrich	T1912
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P-6757
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P-6310
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	480878
Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate	Invitrogen	S11226