המטען טוען על הסעות Kinesin מולקולרית מופעל

Summary

ההסעות מולקולרית המורכבת microtubules פונקציונליות מחליק על פני השטח, דבק kinesin חלבונים המנוע יכול לשמש כמערכת הובלה הננומטרי. הנה, הרכבה של מערכת הסעה טיפוסית מתואר.

Abstract

תאים התפתחו מכונות מולקולריות מתוחכמות, כגון חלבונים kinesin המנוע חוטים microtubule, לתמוך תחבורה תאיים פעיל של המטען. בעוד kinesins זנב תחום נקשר מגוון רחב של מטענים, kinesins תחומים הראש לנצל את האנרגיה הכימית מאוחסנים מולקולות ATP לשלב יחד הסריג microtubule. ארוך, microtubules נוקשה לשמש להובלת מסלולים למרחקים ארוכים תאיים.

מנועים אלה סיבים יכולים גם להיות מועסק בסביבות סינתטי microfabricated כרכיבים של המעבורות מולקולרית ^1. בעיצוב נעשה שימוש תכוף, kinesin מנועים מעוגנים אל פני השטח את המסלול דרך הזנבות שלהם, microtubules פונקציונליות לשמש מרכיבים המטען שנשאו, אשר מונע על ידי מנועים אלה. בהסעות אלה ניתן לטעון עם מטען על ידי ניצול מחייב חזק סלקטיבית בין ביוטין ו streptavidin. מרכיבי מפתח (טובולין biotinylated, streptavidin, ומטענים biotinylated) זמינים מסחרית.

בונים על assay תנועתיות הקלאסי הפוכה ^2, בנייה של המעבורות מולקולרי מפורט כאן. Kinesin חלבוני מנוע הם adsorbed על משטח precoated עם קזאין; microtubules הם polymerized של טובולין biotinylated, דבק kinesin ומצופה לאחר מכן עם streptavidin-rhodamine שכותרתו. ריכוז ה-ATP נשמר ריכוז subsaturating להשיג מהירות microtubule גלישה אופטימלית עבור טעינת מטען ^3. לבסוף, biotinylated והעמסת שכותרתו nanospheres מתווספים כמו מטען. Nanospheres לצרף microtubules כתוצאה מהתנגשויות בין microtubules גלישה ו nanospheres שמירה על פני השטח.

הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות לטעון מגוון רחב של מטענים כגון DNA biotinylated ^{4, 5} נקודות קוונטיות או מגוון רחב של אנטיגנים באמצעות נוגדנים biotinylated ^4-6.

Protocol

1.) Buffers ו ריאגנטים

פתרונות אלה צריכים להיות מוכנים מראש ומאוחסנים aliquots בגודל ובנוחות. Aliquot צריכה להכיל פתרון מספיק עבור ניסוי טיפוסי aliquot טרי אמור לשמש עבור כל assay תנועתיות. תנאי אחסון בגדלים aliquot טיפוסי מוזכרים גם הפרוטוקולים הבאים.

1. BRB80 חיץ, (80 צינורות מ"מ, 1 mM MgCl _2, 1 mM EGTA ב deionized מזוקקים (dd) במים, pH 6.9 המותאמת ידי KOH)

• להמציא פתרון 100 מ"ל מניות של 0.5 M EGTA במים dd. התאם ל-pH 7.0 באמצעות פתרון 2 M NaOH.
• להמציא פתרון 100 מ"ל מניות של 1 M MgCl ₂ במים dd. החיטוי את הפתרון.
• הוסף 24.2 גרם של צינורות 3.1 גרם כדורי KOH ב כ 800 מ"ל מים ומערבבים dd לפזר. התאם את ה-pH 6.9 ל 1 באמצעות פתרון M KOH. הוסף 2 מ"ל של תמיסת 0.5 EGTA המניות M ו 1 מ"ל של 1 פתרון M ₂ מניות MgCl. להעלות את נפח 1000 מ"ל עם מים dd.
• Aliquot לתוך צינורות 50 מ"ל בז ולהקפיא ב -20 ° C לשימוש עתידי. צינור BRB80 כרגע בשימוש ניתן לאחסן 4 ° C או בטמפרטורת החדר.

2. מגנזיום כלוריד, MgCl ₂ (100 מ"מ במים dd)

• מדולל במים dd להשיג הריכוז הסופי של mM 100.
• Aliquot (10 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי

3. Guanosine-5'-טריפוספט, disodium מלח, GTP (25 מ"מ dd המים, pH מותאם 7 על ידי NaOH)

• לשקול החוצה מתמוססים במים dd ולהתאים את pH עד 7 על ידי פתרון 2 M NaOH.
• אמת על ידי מדידת ריכוז ספיגת UV ב 260 ננומטר. (השתמש מקדם הכחדה של 11.7 x 103 ס"מ ^-1 מ ^-1).
• Aliquot (10 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי.

4. Sulfoxide דימתיל, DMSO

• Aliquot (10 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי.

5. טקסול (1 מ"מ DMSO)

• לשקול החוצה מתמוססים DMSO מתחת למכסה המנוע קטר כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ"מ.
• Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי.

6. D-(+), גלוקוז, (2 מ 'במים dd)

• לשקול החוצה מתמוססים במים dd כדי להשיג ריכוז סופי של 2 מ '
• Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי.

7. גלוקוז אוקסידאז, (2 מ"ג / מ"ל ​​ב BRB80)

• להמיס BRB80 להשיג ריכוז סופי של 2 מ"ג / מ"ל.
• Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי.

8. Dithiothreitol, DTT (1 M ב dd מים)

• מתמוססים במים dd מתחת למכסה המנוע קטר כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ '
• Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי.

9. Catalase, (0.8 מ"ג / מ"ל ​​ב BRB80)

• להמיס BRB80 לפחות 2 שלבים כדי להשיג ריכוז סופי של 0.8 מ"ג / מ"ל. קבע את הריכוז בכל שלב על ידי מדידת ספיגת UV ב 276 nm ו 406 nm (השתמש מקדם הכחדה של 3.1 x 10 ^-5 מ ^-1 ס"מ ^-1 ב 276 ננומטר 2.2 x 10 ^-5 מ ^-1 ס"מ ^-1 ב 406 ננומטר המשוואה CL =).
• Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי.

10. אדנוזין 5'-טריפוספט-, ה-ATP (100 מ"מ ב 100mm MgCl ₂₎

• הכן פתרון מלאי של 100 מ"מ MgCl ₂ במים dd. לשקול את אבקה יבשה לפזר בפתרון זה המניה להשיג הריכוז הסופי של 100mm.
• אמת על ידי מדידת ריכוז ספיגת UV ב 260 ננומטר. (השתמש מקדם הכחדה של 15.4 x 10 ס"מ ^{3 -1} מ ^-1).
• Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי.

11. פתרון קזאין (20 מ"ג / מ"ל ​​קזאין ב BRB80)

• הוסף כ 3 גרם קזאין למים 30 מ"ל ב dd צינור 50 בז מ"ל. וורטקס במשך שעה בערך 1 עד מפתחת פתרון עקביות עבה.
• צנטריפוגה ב g כ 15,000 עבור 30 דקות. סינון supernatant דרך 0.5 מיקרומטר ו 0.2 מזרק מסננים מיקרומטר.
• קבע את הריכוז של supernatant על ​​ידי מדידת ספיגת UV ב 280 ננומטר (השתמש מקדם הכחדה של 0.67 ס"מ מ"ל ^-1 מ"ג ^-1). לדלל אותו 20 מ"ג / מ"ל ​​ב BRB80.
• Aliquot (20 נפח μL) בעד 0.5 microcentrifuge צינורות מ"ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי.

2.) תקן פתרונות

אלה מוכנים ביום של הניסוי אמור להיות מושלך לאחר הניסוי נגמר. הכן 1 מ"ל של כל אחד.

1. BRB80CS0.5

• מדולל פתרון קזאין ב BRB80 לריכוז סופי של 0.5 מ"ג / מ"ל ​​ולאחסן על קרח. פתרון זה הוא הציג לתוך התא זרימה לפני kinesin ומסייע לשמור על פעילות kinesin לאחר משטח ספיחה.

2. BRB80CA

• הכן 0.2 מ"ג / מ"ל ​​ו - קזאין 1 mM ATP ב BRB80 ולאחסן על קרח. Kinesin הוא מדולל יותר באמצעות פתרון זה לפני מבוא לתוך התא זרימה.

3. BRB80T

• מדולל פתרון טקסול ב BRB80 לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורת החדר. פתרון זה משמש כדי לייצב microtubules.

4. BRB80CT

• הכן 10 טקסול מיקרומטר ו 0.2 מ"ג / מ"ל ​​קזאין ב BRB80 ולאחסן בטמפרטורת החדר. זה משמש יותר להכין את antifade ופתרונות microtubule.

5. BRB80AF

• הכן 20 מ"מ D-גלוקוז, 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​גלוקוז אוקסידאז, 8 מיקרוגרם / מ"ל ​​Catalase, DTT 10 מ"מ, ו -20 מיקרומטר ATP ב BRB80CT ולאחסן בטמפרטורת החדר. פתרון זה משמש כדי לדלל streptavidin ו nanospheres ו "לשטוף" את streptavidin עודף בתא זרימה. מהירות kinesin יכול להיות נשלט על ידי התאמת ריכוז ה-ATP בפתרון זה.

3). Kinesin הכנה

• אקספרס kinesin מבנה המורכב של wild-type, באורך מלא, שרשרת תסיסנית kinesin melanogaster כבד C-מסוף תג שלו Escherichia coli ולטהר באמצעות טור Ni-נ.ת. ע כמתואר ^6.
• הפוך את aliquots (10 μL כל אחת) ב 0.5 microcentrifuge צינורות מ"ל ולאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי. ריכוז kinesin פעיל aliquots אלה הוא כ 200 ננומטר. ⁷
• לצורך ניסוי טיפוסי, לדלל את הפתרון kinesin 20 פי BRB80CA. תווית KIN20 פתרון ולאחסן על קרח.

4.) Microtubule הכנה

• בתוך צינור 0.5 microcentrifuge מ"ל, להכין 25 μL של פתרון צמיחה: 4 מ"מ MgCl _2, 1 mM GTP ו DMSO 5% (v / v) במאגר BRB80.
• הוסף 6.25 μL של פתרון זה aliquot 20 מיקרוגרם של טובולין biotinylated lyophilized.
• , וורטקס אז מקום באמבט חום 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לפלמר. מדולל 100 של פי BRB80T ו מערבולת בעדינות. תווית MT100 פתרון לאחסון בטמפרטורת החדר.
• ביצוע דילול של פי 10 MT100 ב BRB80AF. תווית MT1000 פתרון.

5.) Streptavidin ו Nanosphere פתרון

הכן AlexaFluor568 שכותרתו streptavidin בריכוז של 100 ננומטר BRB80AF. לייבל זה STV100 ולאחסן על קרח. באופן דומה, לדלל nanospheres 5000 פי פתרון BRB80AF. לייבל זה NS5000 ולאחסן על קרח.

6). Cell תזרים בנייה

לבנות flowcell באמצעות שני coverslips זכוכית מופרדות קלטת דו צדדית. זה התא זרימה הוא כ 2 ס"מ אורך, 1 ס"מ רוחב ו - 100 מיקרומטר גבוהה, יש נפח של כ 20 μL. פתרונות מוצגים לתוך התא זרימה מצד אחד באמצעות פיפטה והחוצה רשעים מן השני באמצעות נייר פילטר.

7). Assay הפוך האסיפה

משטח זכוכית מצופה תחילה קזאין המאפשר kinesin לשמר את הפונקציונליות שלו על ספיחה. לאחר kinesin הוא adsorbed, microtubules מוצגים, אשר מוחזקות בידי kinesin. Microtubules הם מצופים אז עם streptavidin ניאון. אחרי כביסה את streptavidin עודף, biotinylated פוליסטירן והעמסת nanospheres (40 בקוטר ננומטר) הם הציגו. Adsorbed Surface nanospheres נייח להתנגש עם microtubules מרגש לקבל הועמסו על אותם (איור 1).

סדר הזרימה של פתרונות זמן מותר לפני כניסתה של הפתרון הבא להלן.

• BRB80CS0.5, 5 דקות
• KIN20, 5 דקות
• MT1000, 5 דקות
• STV100, 5 דקות
• BRB80AF, 3x
• NS5000

8). מיקרוסקופית

הר התא זרימה על הבמה מיקרוסקופ מיד לאחר הקדמה nanosphere. בניסוי זה, TE2000 U-Eclipse מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ניקון, מלוויל, ניו יורק) מצויד מטרה שמן 100x (NA 1.45), X-120 לצטט מנורה (EXFO, אונטריו, קנדה) ו EMCCD iXon המצלמה (אנדור, דרום וינדזור, CT) היה בשימוש. מסנן FITC קוביה (# 48001) ו קובייה TRITC מסנן (# 48002, Chroma טכנולוגיות, Rockingham, VT) שימשו nanospheres התמונה microtubules respectively על פני השטח התחתון של תאים הזרימה. זמן החשיפה היה 0.2s, ואילו הזמן בין החשיפה היה 2 s.

באיור 1. ציור סכמטי של המעבורות מולקולרית.

Discussion

עם שינויים קלים, פרוטוקול זה שימש בהצלחה על ידי מגוון של קבוצות להרכיב kinesin-microtubule מבחני תנועתיות מבוסס. DTT 10 מ"מ הפתרון הסופי תנועתיות יכול להיות מוחלף עם 0.5% β-mercaptoethanol. תקן פתרונות (BRB80AF, KIN20 ו MT1000) יותר מ 2 שעות הישן לא צריך להשתמש. כל פתרון המכיל microtubules טקסול ובמיוחד ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine-5’-triphosphate (ATP)	Invitrogen	A1049
Biotin tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T333
Casein	Sigma-Aldrich	C-0376
Catalase	Sigma-Aldrich	C-9322
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G-7528
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D-8779
Dithiotreitol (DTT)	Bio-Rad	161-0610
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E-4378
FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)	Invitrogen	F-8766
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G-7016
Guanosine-5’-triphosphate (GTP)	Roche Group	106399
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	63069
Paclitaxel (Taxol)	Sigma-Aldrich	T1912
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P-6757
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P-6310
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	480878
Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate	Invitrogen	S11226