鞭虫感染muris：在肠道内的2型免疫和炎症模型

摘要

鞭muris感染肠道模型是一种Th2型免疫抗小鼠Th2反应产生保护和易感小鼠产生一种病态的Th1反应。

摘要

鞭muris是一个自然的小鼠的病原体和鞭虫物种感染人类和^牲畜 1的生物学和抗原性相似。感染性虫卵经口灌胃，在远端小肠孵化，侵入肠上皮细胞（IECS），该行盲肠和近端结肠隐窝和成熟后的蠕虫释放到环境中^的鸡蛋1。这个模型是一个功能强大的工具来检查因素控制的^CD4 +辅助性T细胞（TH）的激活，以及在肠上皮细胞的变化。免疫反应的抗近交系C57BL / 6和BALB / C，如发生的特点，是由Th2细胞极化的细胞因子（IL - 4，IL - 5和IL - 13）和驱逐的蠕虫病毒，而Th1相关的细胞因子（IL -12，IL - 18，IFN -γ）促进在遗传易感性的AKR / J ^小鼠 2-6的慢性感染。 Th2细胞因子，促进生理肠道微环境的变化，包括IECS的快速周转，杯状细胞的分化，招聘和上皮通透性和平滑肌收缩，所有这一切都^已经在蠕虫驱逐7-15牵连的变化。在这里，我们详细为传播鞭muris可以在随后的实验中使用的鸡蛋的的协议。我们还提供了为感染后的分析建议的样品实验收获。总体而言，该协议将提供的基本工具的研究人员，执行鞭muris小鼠感染模型，它可以用来解决有关的问题在胃肠道以及免疫效应功能的IECS钍倾向。

研究方案

1。传播鞭muris蛋

1. 要生成新的批次的鞭muris蛋，感染20-30免疫缺陷小鼠（如NOD.Cg Prkdc ^SCID IL2RG ^tm1Wjl / SZJ（NSG）或129S6/SvEvTac-Rag2 ^{tm1Fwa（RAG2 - / - ））}或遗传易感性小鼠（如AKR / J）6-8周约300鞭灌胃muris鸡蛋。
2. CO ₂窒息牺牲后32-35天的小鼠。
3. 揭露鼠标的腹侧方和湿用70％乙醇的腹部。
4. 使用镊子把握腹部皮肤，使一个小切口，用剪刀。切开皮肤暴露在腹腔内容。
5. 确定盲肠和大肠近端，并删除它们。
6. 放置在一个10厘米的培养皿贝科改良Eagle培养基（DMEM）含500 U / ml青霉素和500微克/毫升链霉素（P / S）的菜的盲肠和大肠近端。切盲肠公开揭露管腔和蠕虫。使用钳地方盲肠在一个烧杯中的磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻摇动，以除去粪便。
7. 返回盲肠培养皿和使用顺利弯钳（Roboz RS - 5047），轻轻拔出蠕虫和6以及含有5毫升的DMEM + P / S板以及
8. 重复此过程为所有的老鼠。
9. 特百惠容器用湿纸巾保持孵育湿度在37 ° C时4小时，6孔板。
10. 4小时后删除蠕虫使用光滑的弯钳，他们分成2新井的6孔板含5毫升的DMEM + P / S收获在15毫升猎鹰管原作的内容和地点。转速3000 RPM，并删除和储备上清管4小时抗原（可用于细胞restimulation后用PBS透析，典型的蛋白产量是10-20毫克每20只小鼠）和重悬卵灭菌自来水中含有颗粒。
11. 将6孔板，37℃过夜。移走的蠕虫。收获成猎鹰管，并在5分钟3000转的旋转井的内容。一夜之间抗原（可用于鞭银的特定抗体的同型酶联免疫吸附后用PBS透析，典型的蛋白产量是10-20毫克每20只小鼠）和重悬卵含在灭菌自来水沉淀取出上清液和储备。
12. 结合4小时和隔夜的鸡蛋和鸡蛋通过70μm滤网过滤，以消除任何剩余的蠕虫病毒，然后转移到⁷⁵厘米的2烧瓶。保持在一个黑暗的地方所涵盖的6个星期在室温（RT）在铝箔的烧瓶。
13. 蒸压自来水洗净的鸡蛋和50可行的鸡蛋在50μL重悬。要做到这一点，离心5分钟〜50毫升无菌自来水悬浮在3000 RPM的鸡蛋。在玻片上，取出50μL鸡蛋和地点。使用40倍的放大倍率数在50μL可行的鸡胚。稀释50μL给50个可行的鸡蛋的蛋。对于可行鸡蛋的图像，请参阅研究^科珀菲尔德16。

2。 鞭muris蛋（200粒卵/鼠标）的实验小鼠的急性感染

1. 彻底悬浮鸡蛋和删除足够的量来治疗小鼠的数量× 2（如10只小鼠，取200μLx 10只× 2 = 4鸡蛋MLS），并放置在一个14毫升的管理单元帽筒。
2. 反转14毫升的管理单元帽筒组合。到一个适当大小的喂养针1毫升注射器（小鼠重25克，我们用18号1 1 / 2“针）200μL的鸡蛋，一方面颈背鼠标和使用，另一方面管理灌胃鸡蛋。
3. 等待21天。

3。实验收获

1. 第21天牺牲小鼠使用的CO _2。
2. 从小鼠心脏穿刺收集血液，在非肝素的注射器，并储存在4 ° C翌日，分离血清于-20 ° C和冻结血清可用于鞭特定的IgG和IgE的检测采用ELISA法。
3. 揭露鼠标的腹侧方和湿用70％乙醇的腹部。
4. 使用镊子把握腹部皮肤，使一个小切口，用剪刀。切开皮肤和底层膜暴露腹腔内容。
5. 确定小肠，盲肠和结肠。抓住盲肠与钳拉腹腔。用另一双钳推到正确的暴露肠系膜淋巴结（mLNs）小肠。删除mLNs小心，不要削减进入肠道，并在15毫升含2 MLS的媒体猎鹰。如果需要，这些都可以处理，并在体外细胞因子的分析为72小时（4 ^× 6 /毫升在1微克/毫升αCD3/CD28或50μg/ml4H鞭银在24孔板的1毫升）restimulated ELISA和细胞内f低流式细胞仪。
6. 切盲肠和结肠。
7. 使用镊子，推动从远端结肠和地方在2毫升爱思进管粪粒。冻结在-20 ° C。粪粒，可抵抗分子β（RELM -β）表达的免疫印迹分析。
8. 取出盲肠（约0.5厘米）的提示。要删除，粪便举行钳盲肠提示和冲洗，用PBS在培养皿中使用3毫升的注射器和22号针头。在新鲜的4％多聚甲醛5毫升猎鹰捕捉帽筒的地方。保存在4 ° C。这些都可以石蜡包埋，切片和组织学分析的幻灯片上。
9. 取下一块的RNA（〜1厘米）的近端结肠。用500μlRNAlater样品放入2毫升爱思进管。保存在4 ° C。这些样品可通过定量PCR分析mRNA表达。
10. 放置于-20 ° C在一个标签的培养皿中，并冻结其余的盲肠

4。在盲肠鞭muris蠕虫枚举

1. 从冰箱放置在培养皿〜5毫升的水盘取出盲肠。
2. 用剪刀剖开盲肠暴露管腔。
3. 与钳举行的盲肠和大力摇晃盲肠删除大部分粪便。
4. 盲肠转移到另一个培养皿中含有水和使用光滑的弯钳轻轻刮去IECS的根本组织。
5. 盲肠转移到一个新的培养皿中含有水，并积极与钳刮余下的组织，翻录成小块的组织。
6. 使用解剖显微镜计数所有的蠕虫在所有的培养皿3。正如你发现一种蠕虫病毒删除从盘，以确保相同的蠕虫，不计两次。如果蠕虫被损坏（即一半打破）只计算厚或薄的两端，以获得准确计数。

5。代表性的成果

鞭muris感染模型使研究人员能够量化寄生虫负担和全身免疫反应，以及病理检查远端盲肠内的炎症反应。当收获盲肠腔暴露出来， 鞭虫蠕虫可以枚举使用解剖显微镜（图1A - B）。 鞭免疫力参数，还包括抗动物抗体亚型，切换到IgG1的（与Th2型免疫相关），和IgG2a易感动物（与Th1型免疫相关）（图1C ）。杯状细胞特异性蛋白抵抗分子β（RELM -β）的表达与鞭间隙和Western blot分析（图2）检测。盲肠末端的部分，可以与碘酸雪夫（PAS）染色评估杯状细胞的反应和对感染的反应程度的肠道炎症（图3）。

图1。量化的免疫力鞭muris。 （一）抗（B6）小鼠驱逐鞭muris感染后第21天。相比之下，成为慢性感染易感（AKR / J）小鼠与鞭虫 ，导致寄生虫建立。每个条形代表的平均± SEM 4-8动物每组。 （二）蠕虫是使用解剖显微镜计数。顶板显示在隔离蠕虫，底部面板显示蠕虫IECS和粪便的存在。 （三） 鞭特定的IgG2a抗体滴度排泄鞭抗原（O / N银，5微克/涂层钢板是由稀释血清的ELISA（1:2稀释，在1:20稀释开始和结束在1:2560）毫升）。易感AKR / J小鼠鞭特异性血清IgG2a水平较高，特别是较耐B6小鼠。

图2。 鞭muris间隙与杯状RELM -β细胞特异性蛋白⁷表达 。 RELM -β的生产，可以检测到从鞭虫感染的耐药（B6）的粪粒，但不容易（AKR / J）小鼠免疫印迹分析。每个通道是代表一个单一的动物，（N）=天真，（TM）= 21天鞭虫感染小鼠。

图3。远端盲肠以下鞭虫感染的病理组织学检查。 5-7微米的远端盲肠段与保安局首席助理局长染色。杯状细胞增生和粘液生产明显耐药（B6），但不容易（AKR / J） 小鼠，鞭虫感染。

讨论

该协议的细节了一个标准的高剂量急性鞭muris感染研究者的要求，可以修改。例如，老鼠可以牺牲和组织在不同的日子里收获。要确定小鼠已成功建立了完整的蠕虫负担，他们可以被牺牲的第14天，在这一点所有小鼠，应随身携带了约200蠕虫的负担。也可被感染小鼠的32天检测到任何蠕虫将达到成熟阶段，并会维持其生命期限的主机。此外，该协议可以适应慢性鞭虫muris感染模型。要?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
动物饲养针（18 × 1 ½“）	波普尔	7912
光滑的弯钳	Roboz	RS - 5047
DMEM培养液	Gibco公司	11965
NOD.Cg Prkdc SCID IL2R gtm1Wjl / SZJ（NSG）	杰克逊实验室	005557	这些都是我们所用的老鼠，但是，任何免疫缺陷小鼠或敏感品系的工作。
RNAlater	Qiagen公司	76104
2毫升管	爱思进	MCT - 200 - C
15毫升管	鹘	352096
6孔板	鹘	353046
多聚甲醛	电子显微学	15710
α-RELMβ抗体	PeproTech公司	0694270Rb