Trichuris muris זיהום: מודל של חסינות סוג 2, דלקת במעיים

Summary

זיהום Trichuris muris הוא מודל מעיים של חסינות Th2 שבו עכברים עמיד ליצור תגובת Th2 מגן עכברים רגישים ליצור תגובה פתולוגית Th1.

Abstract

Trichuris muris הוא פתוגן טבעי של עכברים דומה ביולוגית antigenically למינים של Trichuris כי להדביק בני אדם ובעלי חיים ^1. ביצי התולעת ניתנים על ידי gavage אוראלי, בוקעות במעי הדק הדיסטלי, לפלוש לתאי האפיתל במעי (IECs) כי קו מאורות של cecum ואת המעי הגס הפרוקסימלי ועל התבגרות תולעים שחרור ביצים לתוך הסביבה ^1. מודל זה הוא כלי רב עוצמה לבחון את הגורמים CD4 ⁺ T שליטה עוזר (ה ') בתא ההפעלה, כמו גם שינויים באפיתל המעי. התגובה החיסונית המתרחשת זנים טהורים עמידים, כגון C57BL / 6 BALB / c, מאופיין ציטוקינים Th2 מקוטב (IL-4, IL-5 ו-IL-13) וגירוש של תולעים בזמן Th1 הקשורים ציטוקינים (IL -12, IL-18, IFN-γ) לקדם דלקות כרוניות AKR רגישים מבחינה גנטית / עכברים J ^2-6. ציטוקינים Th2 לקדם שינויים פיזיולוגיים אצל microenvironment המעי כולל תחלופה מהירה של IECs, התמיינות תאים הגביע, גיוס ושינויים בחדירות אפיתל והתכווצות שרירים חלקים, אשר כולם היו מעורבים בגירוש תולעת ^7-15. כאן אנו פרט פרוטוקול עבור הפצת Trichuris ביצים muris אשר ניתן להשתמש בהם בניסויים הבאים. כמו כן אנו מספקים מדגם ניסיוני הקציר עם הצעות ניתוח שלאחר זיהום. בסך הכל, פרוטוקול זה יספק לחוקרים את הכלים הבסיסיים לביצוע muris זיהום Trichuris העכבר מודל אשר יכול לשמש כדי לענות על שאלות הנוגעות נטייה Th במערכת העיכול, כמו גם פונקציות מפעיל החיסונית של IECs.

Protocol

1. הפצת Trichuris ביצים muris

1. כדי ליצור קבוצות חדשות של ביצים Trichuris muris, להדביק 20-30 עכברים immunodeficient (למשל NOD.Cg-Prkdc ^SCID Il2rg ^tm1Wjl / SzJ (NSG) או 129S6/SvEvTac-Rag2 ^tm1Fwa (RAG2 ^{- / -))} או עכברים רגישים מבחינה גנטית ( למשל. AKR / י) כי הם 6-8 שבועות עם כ 300 ביצים Trichuris muris ידי gavage הפה.
2. לאחר 32-35 ימים להקריב את העכברים בחנק CO _2.
3. לחשוף את הצד הגחוני של העכבר רטובה את הבטן עם אתנול 70%.
4. מלקחיים שימוש לתפוס את עור הבטן לעשות חתך קטן בעזרת מספריים. חותכים את העור כדי לחשוף את תכולת הבטן.
5. זהה את cecum ואת המעי הגס הפרוקסימלי, ולהסיר אותם.
6. מניחים את cecum ואת המעי הגס הפרוקסימלי של צלחת פטרי המכילה 10 ס"מ השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) עם 500 U / ml פניצילין 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין (P / S). חותכים את cecum לפתוח לחשוף את לומן ואת תולעים. בעזרת מלקחיים cecum מקום בכוס של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) וללחוץ בעדינות כדי להסיר את הצואה.
7. חזור cecum אל צלחת פטרי באמצעות מלקחיים מעוקל חלקה (Roboz RS-5047) בעדינות לשלוף תולעים למקם אותם היטב של צלחת 6 היטב המכיל 5 MLS ש DMEM + P /
8. חזור על תהליך זה עבור כל העכברים.
9. שים 6 צלחת היטב במיכל פלסטיק עם מגבת נייר לחה כדי לשמור על לחות לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
10. לאחר 4 שעות להסיר תולעים באמצעות מלקחיים מעוקל חלקה לפצל אותם לתוך 2 בארות חדשות של צלחת 6 היטב DMEM המכיל 5 מ"ל + P / S. קציר את תוכן היטב את המקום המקורי של צינור 15 בז מ"ל. ספין צינור ב 3000 סל"ד ולהסיר ובמילואים supernatant כמו אנטיגן 4 שעה (יכול לשמש restimulation התא לאחר PBS דיאליזה, שם התשואות חלבון טיפוסי הם 10-20 מ"ג לכל 20 עכברים) ו resuspend ביצה המכילים גלולה במי ברז autoclaved.
11. שים את צלחת 6 גם חזרה 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הסר להיפטר התולעים. קציר את התוכן של בארות לתוך צינור בז ספין בסל"ד 3000 דקות 5. הסר supernatant ובמילואים כמו אנטיגן לילה (ניתן להשתמש Trichuris Ag ELISAs אלוטיפ נוגדן ספציפי לאחר PBS דיאליזה, שם התשואות חלבון טיפוסי הם 10-20 מ"ג לכל 20 עכברים) ו המכילות ביצים resuspend גלולה במי ברז autoclaved.
12. שלב 4 שעות וביצים לילה ולסנן את הביצים דרך המסננת 70μm להסיר שאריות תולעים מכן להעביר לתוך בקבוקון 75 ס"מ ^2. שמור את הבקבוק במקום חשוך מכוסה בנייר כסף במשך 6 שבועות בטמפרטורת החדר (RT).
13. לשטוף ביצים במי ברז autoclaved ו resuspend בגיל 50 ביצים קיימא μl 50. כדי לעשות זאת, צנטריפוגה ביצים בסל"ד 3000 דקות 5 ו resuspend במים 50 מ"ל ~ ברז סטרילי. הסר 50 ביצים μl מקום בשקופית זכוכית. באמצעות הגדלה 40X לספור את מספר הביצים embryonated קיימא μl 50. מדולל ביצים לתת 50 ביצים קיימא μl 50. לקבלת תמונות של ביצי קיימא עיין מחקר שנערך על ידי Kopper ו מנספילד ^16.

2. דלקת חריפה של עכברי הניסוי עם Trichuris muris ביצים (200 ביצים / עכבר)

1. ביצים resuspend ביסודיות להסיר נפח מספיק כדי לטפל במספר של עכברים X 2 (למשל עבור 10 עכברים לוקחים 200 μl x 10 x 2 = עכברים MLS 4 ביצים) וגם למקם אותם שפופרת 14 מ"ל הצמד כובע.
2. הפוך את הצמד 14 מ"ל צינור כובע לערבב. מביא 200 μl של ביצים לתוך מזרק 1 מ"ל על מחט בגודל המתאים האכלה (עבור עכברים במשקל 25 גרם השתמשנו 18 מד 1 1 / 2 "מחטים). בעורפו ב יד אחת על העכבר בעזרת היד השנייה לנהל את הביצים על ידי gavage אוראלי .
3. חכה 21 ימים.

3. ניסיוני קציר

1. ביום 21 להקריב את העכברים באמצעות ה-CO _2.
2. איסוף דם מעכברים ידי לנקב לב, בתוך מזרק ללא heparinized, ולאחסן ב 4 ° C. למחרת לבודד בסרום להקפיא ב -20 ° C. סרום ניתן להשתמש לצורך זיהוי של Trichuris ספציפי IgGs ו IgE על ידי ELISA.
3. לחשוף את הצד הגחוני של העכבר רטובה את הבטן עם אתנול 70%.
4. מלקחיים שימוש לתפוס את עור הבטן לעשות חתך קטן בעזרת מספריים. חותכים את העור ואת קרום הבסיסי לחשוף את תכולת הבטן.
5. זהה את המעי הדק, cecum והמעי הגס. תפוס את cecum עם מלקחיים ולשלוף של חלל הבטן. עם זוג נוסף של מלקחיים לדחוף המעי הדק מעל ימינה לחשוף את בלוטות לימפה mesenteric (mLNs). הסר את mLNs נזהרים שלא לחתוך את המעיים ומכניסים 15 מ"ל בז המכיל 2 MLS של התקשורת. אם תרצה אלה יכולים להיות מעובדים restimulated במבחנה (4x10 ⁶ / מ"ל 1 מ"ל ב 24 צלחות היטב עם αCD3/CD28 מיקרוגרם / מ"ל 1 או עם 50μg/ml 4H Trichuris Ag) עבור 72 שעות לניתוח ציטוקינים על ידי ELISA ו-F תאייםנמוך cytometry.
6. חותכים את cecum והמעי הגס.
7. בעזרת מלקחיים, לדחוף החוצה כדורי צואה מן המעי הגס הדיסטלי מקום ובכל צינור 2 Axygen מ"ל. להקפיא ב -20 ° C. כדורי צואה ניתן לנתח על ידי כתם המערבי לביטוי של resistin כמו β-מולקולה (RELM-β).
8. הסר את הקצה של cecum (~ 0.5 ס"מ). כדי להסיר צואת להחזיק קצה cecum עם מלקחיים ולשטוף עם PBS באמצעות מזרק 3 מ"ל ו - 22-מחט מד בצלחת פטרי. מקום paraformaldehyde 4% טרי צינור 5 מ"ל פלקון כובע הצמד. חנות ב 4 ° C. אלה יכולים להיות מוטבע פרפין, מחולק רכוב על שקופיות לניתוח היסטולוגית.
9. הסר חתיכת המעי הגס הפרוקסימלי (~ 1 ס"מ) של RNA. שים מדגם לתוך צינור 2 Axygen מ"ל עם RNAlater 500 μl. חנות ב 4 ° C. דגימות אלו ניתן לנתח ביטוי mRNA על ידי qPCR.
10. מניחים את שאר cecum בצלחת פטרי שכותרתו להקפיא ב -20 ° C.

4. ספירת Trichuris muris תולעים cecum

1. הסר cecum מהמקפיא ומניחים בצלחת פטרי המכילות ~ 5 מ"ל מים.
2. בעזרת מספריים, חותכים לפתוח cecum לחשוף את לומן.
3. החזק את cecum עם מלקחיים במרץ לנער את cecum להסיר את מרבית הצואה.
4. העברת cecum אל צלחת פטרי אחר המכיל מים באמצעות מלקחיים מעוקל חלק בעדינות לגרד את IECs הרקמה הבסיסית.
5. העברת cecum כדי בצלחת פטרי חדשה המכילה מים במרץ לגרד רקמות הנותרים עם מלקחיים, קורעת את הרקמה לחתיכות קטנות.
6. שימוש במיקרוסקופ לנתח כדי לספור את כל התולעים בכל 3 של בצלחות פטרי. כפי שאתם מוצאים תולעת להסיר אותו בצלחת כדי להבטיח את התולעת אותו לא נספר פעמיים. אם תולעים פגומים (שבורות כלומר במחצית) לספור רק מסתיים עבה או דק כדי לקבל מספר מדויק.

5. נציג תוצאות

המודל muris Trichuris זיהום מאפשר לחוקרים לכמת נטל טפיל התגובה החיסונית מערכתית, כמו גם בהיסטולוגיה לבחון את התגובה הדלקתית בתוך cecum הדיסטלית. כאשר לומן של cecum שנקטפו חשוף, תולעים Trichuris ניתן המנויים באמצעות מיקרוסקופ לנתח (איור 1A-B). פרמטרים של חסינות Trichuris כוללים גם אלוטיפ נוגדן מעבר IgG1 (המשויך חסינות מסוג Th2) אצל בעלי חיים עמידים, IgG2a (המשויך חסינות מסוג Th1) בבעלי חיים רגישים (תרשים 1C). הביטוי של הגביע תא ספציפי חלבון resistin כמו מולקולות β (RELM-β) מזוהה עם אישור של Trichuris והוא לזיהוי על ידי ניתוח כתם המערבי (איור 2). החלק הדיסטלי של cecum יכול להיות מוכתם תקופתיים חומצה שיף (PAS) כדי להעריך את התא הגביע התגובות והיקף דלקת מעיים בתגובה לזיהום (איור 3).

באיור 1. כימות חסינות Trichuris muris. (א) עמיד (B6) עכברים לגרש muris Trichuris על ידי 21 יום שלאחר זיהום. לעומת זאת, רגישים (AKR / J) עכברים נדבקים כרוני עם Trichuris, וכתוצאה מכך הקמת טפיל. כל עמודה מייצגת את הממוצע ± SEM של 4-8 חיות לכל קבוצה. (ב) תולעים נספרים באמצעות מיקרוסקופ לנתח. הפאנל למעלה מראה תולעים בבידוד, לוח התחתונה מראה תולעים בנוכחות IECs ובצואה. (ג) Trichuris ספציפי titres IgG2a נקבעים על ידי ELISA של נסיוב מדוללת (01:02 דילול, החל מהשעה 1:20 דילול ומסתיים 1:2560) על צלחות מצופה אנטיגן הפרשה Trichuris (O / N Ag, 5 מיקרוגרם / מ"ל). רגישים AKR / י עכברים בעלי רמות גבוהות במיוחד של IgG2a Trichuris ספציפיים בסרום מאשר B6 עכברים עמידים.

איור 2. חיסול של Trichuris muris קשורה ביטוי הגביע תאים ספציפיים לחלבון RELM ^β-7. RELM-β הייצור ניתן להבחין בין כדוריות צואה מן עמידים Trichuris נגועים (B6), אבל לא רגישים (AKR / J) עכברים ידי ניתוח כתם המערבי. נתיב כל נציג של חיה אחת, (N) = תמים, (TM) = 21 יום Trichuris עכברים נגועים.

איור 3. בדיקה היסטולוגית של זיהום cecum דיסטלי הבאים Trichuris. סעיפים 5-7 מיקרומטר של cecum דיסטלי מוכתם PAS. תא וגביע היפרפלזיה ייצור ליחה ניכרות עמיד (B6), אבל לא רגישים (AKR / J) עכברים הבאים זיהום Trichuris.

Discussion

פרוטוקול זה פרטים מנה ברמה גבוהה חריפה Trichuris muris זיהום אשר יכול להיות שונה כפי שנדרש על ידי החוקר. למשל, בעכברים אפשר להקריב ורקמות שנקטפו בימים שונים. כדי לקבוע כי העכברים הקימו בהצלחה נטל תולעת מלא הם יכולים להקריב ביום 14, ובשלב זה כל העכברים צריכים לשאת בנטל של ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
האכלת בעלי חיים מחטים (18 x ½ 1 ")	פופר	7912
מלקחיים מעוקל חלקות	Roboz	RS-5047
DMEM	Gibco	11965
NOD.Cg-Prkdc SCID Il2r gtm1Wjl / SzJ (NSG)	ג'קסון מעבדות	005557	אלה הם העכברים השתמשנו, לעומת זאת, כל העכברים immunodeficient או זן רגיש צריך לעבוד.
RNAlater	Qiagen	76104
2 מ"ל צינורות	Axygen	MCT-200-C
15 צינורות מ"ל	בז	352096
6 צלחות טוב	בז	353046
Paraformaldehyde	מיקרוסקופית אלקטרונים המדע	15710
α-RELMβ נוגדן	PeproTech Inc	0694270Rb